傳統(tǒng)泡菜制作與乳酸菌的分離觀察

高悅皓

（廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院，福建廈門(mén) 361000）

泡菜是一種獨(dú)特的乳酸發(fā)酵蔬菜制品，食用后會(huì)攝入乳酸菌及乳酸等代謝產(chǎn)物，有助于調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，達(dá)到預(yù)防疾病和保健的目的[1-2]。我國(guó)泡菜歷史十分悠久，北魏賈思勰的《齊民要術(shù)》一書(shū)中，就有制作泡菜的敘述，可見(jiàn)至少1 400多年前，中國(guó)就有制作泡菜的歷史。在清朝，川南、川北民間還將泡菜作為嫁奩之一，足見(jiàn)泡菜在人們生活中所占地位[3]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制作傳統(tǒng)泡菜，測(cè)定泡菜的理化指標(biāo)，對(duì)制作泡菜不同階段中的乳酸菌進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)與形態(tài)觀察，了解發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌的數(shù)量變化，同時(shí)通過(guò)自然發(fā)酵與人工加入乳酸菌兩壇泡菜的對(duì)比，探究接種乳酸菌制作泡菜是否能提升制作速率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

涼白開(kāi)、圓白菜、大蒜、花椒、干辣椒、生姜、冰糖、碘鹽、蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸鈉、酵母提取物、檸檬酸二胺、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、吐溫80、溴甲酚紫、瓊脂、泡菜乳酸菌粉、NaCl、pH計(jì)緩沖液、革蘭氏染色液（結(jié)晶紫、碘液、95%乙醇、番紅）、芽孢染色液（孔雀綠染液、7.6%飽和孔雀綠水溶液、番紅水溶液）、3%過(guò)氧化氫溶液、放線菌酮。

1.2 儀器

SQP電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）］、培養(yǎng)皿、pH計(jì)、燒杯、厭氧培養(yǎng)袋、MGC-350BP-2光照培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）、O2YMPVS CX21生物顯微鏡、接種環(huán)、C21-SDHCB06G電磁爐。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 傳統(tǒng)泡菜的制作

購(gòu)買(mǎi)新鮮的圓白菜，清洗，瀝干，切分，用電子天平稱(chēng)取224.00 g裝入泡菜缸，同時(shí)加入13.86 g大蒜、4.62 g花椒、4.62 g干辣椒、4.62 g生姜、36.96 g冰糖和36.96 g碘鹽，最后向其中加入700 mL涼白開(kāi)，封壇并做好標(biāo)記存于陰涼處；取另一個(gè)泡菜缸，重復(fù)第一個(gè)的操作，并在封壇前向其中加入1包泡菜乳酸菌粉，做好標(biāo)記同樣存放于陰涼處。

1.3.2 MRS培養(yǎng)基及生理鹽水的配制

稱(chēng)取蛋白胨1 g、牛肉膏1 g、葡萄糖 5 g、乙酸鈉0.5 g、酵母提取物0.5 g、檸檬酸二胺0.2 g、磷酸氫二鉀0.02 g、硫酸鎂0.02 g、吐溫80 0.1 g、溴甲酚紫 0.04 g及瓊脂 1.5～2.0 g，加蒸餾水至100 mL，用電磁爐煮至徹底融化后裝瓶備用。

稱(chēng)取0.85 g氯化鈉固體，溶解于100 mL蒸餾水中，再通過(guò)梯度稀釋配制多種梯度的0.85%無(wú)菌生理鹽水。

1.3.3 乳酸菌pH值測(cè)定方法

用移液槍從泡菜缸內(nèi)取5 mL泡菜液于燒杯中，對(duì)pH計(jì)進(jìn)行校正后，對(duì)其進(jìn)行pH測(cè)定。

1.3.4 乳酸菌培養(yǎng)方法

從泡菜缸中取泡菜液，估算合適的梯度，進(jìn)行稀釋平板涂布，并將培養(yǎng)皿封入?yún)捬跖囵B(yǎng)袋后放入37 ℃光照培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.5 革蘭氏染色、芽孢染色和接觸酶測(cè)試方法

（1）革蘭氏染色。涂片、干燥，并在酒精燈火焰上過(guò)火固定，然后滴加結(jié)晶紫染色1～2 min，后用水沖洗，接著滴加碘液染色1 min后，用水沖洗，甩盡殘余水，再用95%乙醇沖洗30 s，嚴(yán)格控制時(shí)間和濃度，然后立即用水沖洗。接著用番紅覆蓋涂片進(jìn)行復(fù)染，染3～5 min，水洗，晾干，最后先用低倍鏡觀察，后用高倍鏡觀察。

（2）接觸酶測(cè)試。先在載玻片上加1滴3%H2O2，然后用非金屬接種工具刮取斜面或平板上的培養(yǎng)物與其混合，再用肉眼或低倍鏡觀察其冒氣情況。

（3）芽孢染色。將培養(yǎng)24 h左右的菌體，進(jìn)行涂片、干燥、固定，再滴加3～5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上，用飽和的孔雀綠水溶液（約7.6%）染10 min，然后傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止，再用番紅水溶液復(fù)染1 min，水洗，最后待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。

1.3.6 乳酸菌形態(tài)、數(shù)量觀察

對(duì)培養(yǎng)的平板上的乳酸菌進(jìn)行肉眼計(jì)數(shù)和放大鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜制作過(guò)程的觀察

經(jīng)實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，泡菜第1 d是綠色，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，其顏色逐漸變?yōu)辄S色，泡菜液從澄清逐漸變渾濁，這是泡菜發(fā)酵過(guò)程中色素溶解、細(xì)菌代謝、乳酸菌演替所產(chǎn)生的正?，F(xiàn)象[4]。

2.2 泡菜液pH值

由圖1可知，未加乳酸菌的泡菜液的pH值隨著發(fā)酵天數(shù)的增加呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，在第3 d左右開(kāi)始逐漸趨于平緩[5]，最終pH值在3.22左右。pH值最開(kāi)始升高是因?yàn)榘l(fā)酵剛開(kāi)始時(shí)蔬菜表面還存在一些革蘭氏陰性好氧菌和一些氧化酵母菌，它們利用最初一段時(shí)間的有氧環(huán)境和乳酸菌產(chǎn)生的乳酸進(jìn)行代謝，造成乳酸消耗，最終讓pH值有短暫的上升過(guò)程。

圖1 兩缸泡菜液的pH值隨時(shí)間的變化曲線圖

通過(guò)加入乳酸菌的泡菜液的pH值變化曲線可以看出，pH值從一開(kāi)始便呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，并且在第2 d左右就開(kāi)始逐漸趨于平緩，最終pH值在3.10左右。這與未加乳酸菌不同的原因是加入大量乳酸菌后，從一開(kāi)始乳酸菌就在泡菜中占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生大量乳酸，酵母菌等其他雜菌開(kāi)始便難以生長(zhǎng)，所以pH值從一開(kāi)始便呈現(xiàn)出下降的趨勢(shì)。

通過(guò)兩者對(duì)比，可以看出加入乳酸菌的泡菜pH值趨于平緩的時(shí)間要早于未加乳酸菌的泡菜，說(shuō)明加入乳酸菌可以加快泡菜的制作。最終到達(dá)的pH值也是加入乳酸菌的泡菜要略低于未加乳酸菌的泡菜，推測(cè)原因是乳酸菌數(shù)量多所產(chǎn)乳酸也較多，雖然經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的種群數(shù)量變化和乳酸動(dòng)態(tài)變化會(huì)逐漸趨于一致，但是加入乳酸菌的泡菜最后酸性仍會(huì)略強(qiáng)一些。

2.3 乳酸菌優(yōu)勢(shì)度檢驗(yàn)

由圖2革蘭氏染色結(jié)果可以看出，未加乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株幾乎均被染為紫色，只有少量為紅色，說(shuō)明絕大部分菌株都是以乳酸菌為代表的革蘭氏陽(yáng)性菌。未加乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株少數(shù)呈現(xiàn)紅色的原因可能是有少量酵母菌和大腸桿菌等革蘭氏陰性菌在培養(yǎng)第2 d還沒(méi)完全死亡或染色時(shí)番紅染液浸染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[6]。

圖2 培養(yǎng)基菌株革蘭氏染色結(jié)果圖（10×100）

由圖3芽孢染色結(jié)果可知，未加乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株和加入乳酸菌粉泡菜液培養(yǎng)基中的菌株幾乎均被染為紅色，極少數(shù)為綠色，說(shuō)明絕大部分都是菌體。極少數(shù)呈現(xiàn)綠色的原因可能是有少量枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌在培養(yǎng)第2 d天還沒(méi)完全死亡或染色時(shí)孔雀石綠染液浸染時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。

圖3 培養(yǎng)基菌株芽孢染色結(jié)果圖（10×40）

由圖4接觸酶測(cè)試可知，菌株與H2O2接觸時(shí)肉眼幾乎看不到任何變化，說(shuō)明泡菜缸中的細(xì)菌幾乎不含產(chǎn)氣菌。

圖4 培養(yǎng)基菌株接觸酶測(cè)試結(jié)果圖

綜合以上3個(gè)檢測(cè)試驗(yàn)，可以排除絕大部分革蘭氏陰性菌、芽孢桿菌和產(chǎn)氣菌，說(shuō)明泡菜缸內(nèi)的菌體幾乎全部為革蘭氏陽(yáng)性菌、厭氧細(xì)菌——乳酸菌。

2.4 乳酸菌數(shù)量的觀察

從圖5可以看出，未加乳酸菌的泡菜缸內(nèi)乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在第4 d數(shù)量達(dá)到最多，且在第7 d后仍會(huì)降低，但推測(cè)會(huì)逐漸趨于平緩。推測(cè)原因是最開(kāi)始乳酸菌數(shù)量還未達(dá)到飽和，鹽分使白菜中的可溶性物質(zhì)進(jìn)入泡菜液為乳酸菌提供營(yíng)養(yǎng)，且逐漸形成的無(wú)氧環(huán)境會(huì)讓乳酸菌在與其他雜菌的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)，從而加速增長(zhǎng)，在第4 d數(shù)量由于資源的限制到達(dá)飽和值，且過(guò)多的乳酸抑制了乳酸菌的生長(zhǎng)，其數(shù)量開(kāi)始逐漸下降，但由于實(shí)驗(yàn)天數(shù)有限，因此統(tǒng)計(jì)到第7 d后仍呈下降趨勢(shì)，但推測(cè)會(huì)逐漸趨于平緩，達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[7-9]。加入乳酸菌的泡菜缸內(nèi)乳酸菌數(shù)量呈現(xiàn)先下降后趨于平緩的趨勢(shì)，從第5 d開(kāi)始乳酸菌數(shù)量基本保持不變。這可能是因?yàn)閯傞_(kāi)始時(shí)乳酸菌是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)種群，其數(shù)量超過(guò)了飽和值，因此會(huì)一直下降以達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡[10]。

圖5 兩缸泡菜液的乳酸菌數(shù)量隨時(shí)間的變化曲線圖

通過(guò)兩者對(duì)比，可以看出加入乳酸菌的泡菜缸內(nèi)乳酸菌數(shù)量相較于未加乳酸菌會(huì)更快到達(dá)穩(wěn)定值，且最后的穩(wěn)定值要更高。

2.5 乳酸菌形態(tài)的觀察

如圖6所示，乳酸菌菌落大致有以下幾種形態(tài)特征：①邊緣整齊，表面光滑，中央有凸起或扁平的白色或乳白色菌落，菌落直徑在0.5～1.0 mm；②邊緣不整齊、表面粗糙無(wú)光澤、中央有凸起或中央扁平的褐色或乳黃色半透明菌落，直徑約為0.5～3.0 mm；③圓形、邊緣整齊、表面光滑、扁平隆起的灰白色菌落，菌落直徑在1.0～2.0 mm；④圓形、邊緣整齊、不透明、中心凸起的乳白色菌落，菌落直徑在1.0 mm左右；⑤圓形邊緣光滑半透明微凸起的白色菌落，菌落直徑在1.0 mm左右。

圖6 MRS培養(yǎng)基乳酸菌觀察圖

3 結(jié)論

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自然發(fā)酵的傳統(tǒng)泡菜的pH值會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低并在第3 d開(kāi)始逐漸趨于平緩的趨勢(shì)，且最高值出現(xiàn)在第1～2 d，乳酸菌數(shù)量會(huì)呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，推測(cè)也會(huì)逐漸趨于平緩，最高值出現(xiàn)在第4 d左右，這是由于乳酸菌在逐漸無(wú)氧的內(nèi)部環(huán)境里逐漸在與其他雜菌的競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)的原因。加入乳酸菌發(fā)酵的泡菜的pH值從一開(kāi)始便會(huì)逐漸下降，在第2 d左右就會(huì)逐漸趨于平緩，乳酸菌數(shù)量一開(kāi)始就下降并在第5 d開(kāi)始逐漸趨于平緩，這是由于乳酸菌數(shù)量一開(kāi)始就處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，超過(guò)了資源的可容納范圍，逐漸下降并最終達(dá)到與資源相適應(yīng)的動(dòng)態(tài)平衡。通過(guò)兩種泡菜對(duì)比分析，可以看出加入乳酸菌可以明顯加快泡菜的制作速度，且最后的pH和乳酸菌數(shù)量都會(huì)略多于自然發(fā)酵的泡菜。