鴨源大腸桿菌的分離鑒定及致病性分析

董洪燕，宋海港，朱善元，于圣青，謝 軍，洪雙鵬，郭長明，徐 海，高月秀

(1.江蘇農牧科技職業學院，泰州 225300；2.揚州大學獸醫學院，揚州 225009；3.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241)

禽致病性大腸桿菌(APEC)是禽大腸桿菌病的主要病原，可引起禽類的氣囊炎、肝周炎、心包炎等癥狀，也是導致水禽業經濟損失的重要原因之一[1]。近年來，隨著水禽業的快速發展，養殖規模迅速擴大和增加，鴨源大腸桿菌病的發生也日益頻繁和復雜，且其血清型眾多，常引起繼發性感染，從而給該病的防控帶來巨大的困難[2-3]。禽致病性大腸桿菌含有多種毒力因子，其致病性由多種毒力基因協同作用[4]，目前雞源的毒力因子檢測研究較多，鴨源的較少[5]。此外，經相關研究表明，特定的O抗原與大腸桿菌的致病性有關[6]，同時血清型與菌株所攜帶的毒力基因也存在一定關系[7-8]。因此，加強鴨源大腸桿菌病的監測與致病性分析，對養鴨場的健康發展以及研究鴨源大腸桿菌的血清型、毒力基因與致病性之間的相互關系具有重要意義。本研究從江蘇、江西以及安徽地區不同養鴨場病死鴨的病料中分離鴨源大腸桿菌，對其進行生化和血清型鑒定、毒力基因檢測、雛鴨致病性試驗，并對毒力較強的菌株進行生長曲線以及半數致死量(LD50)測定，為鴨源大腸桿菌的防控以及致病機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

病料采自江蘇、江西、安徽地區不同養鴨場病死鴨的心臟、肝臟、腎臟等臟器，共采集293份病料，其中江蘇95份，江西110份，安徽88份。300只7日齡櫻桃谷鴨購自泰州麗佳禽業有限公司。0.45%氯化鈉、GN生化鑒定卡購自梅里埃公司；2×ESTaqMaster Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司；DNA Marker購自TaKaRa公司；LB培養基、MH培養基和麥康凱培養基均購自北京陸橋公司；GelRed染劑購自Biotium公司；大腸桿菌O1、O2、O18和O78單因子診斷血清均購自SSI公司。

1.2 方法

1.2.1 鴨源大腸桿菌的分離鑒定 無菌采取病死鴨心臟、肝臟、腎臟等臟器組織劃線接種于麥康凱鑒別培養基中，37 ℃培養18～24 h，觀察菌落形態，再挑取疑似菌落分別轉接于LB培養基，37 ℃，200 r/min培養18～24 h，運用全菌裂解法[9]提取細菌DNA。參照文獻[1]設計大腸桿菌鑒定引物(表1)，對分離菌株進行PCR鑒定，PCR結果經北京擎科生物科技有限公司測序，在GenBank數據庫中進行BLAST比對分析。

1.2.2 生化鑒定 將分離到的菌株劃線接種于LB平板中，37 ℃培養18 h后，用0.45%氯化鈉調成0.50～0.62個麥氏比濁度的菌懸液，再將菌懸液和GN生化鑒定卡片放于VITEK微生物生化鑒定儀中進行鑒定。

1.2.3 O血清型鑒定 參照文獻[6]中大腸桿菌血清型鑒定引物(表1)以及PCR方法對鴨源大腸桿菌分離株的血清型進行初步鑒定，鑒定為陽性的分離株再進行玻板凝集試驗驗證[1]。

1.2.4 毒力基因檢測 根據相關文獻[4]設計18種毒力基因的檢測引物(表1)。引物均由賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成。 PCR反應體系20 μL：2×Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

表1 引物信息

1.2.5 雛鴨致病性試驗 取300只7日齡健康櫻桃谷鴨隨機分成74個試驗組及1個對照組(4只/組)，將新鮮培養的74株鴨源大腸桿菌分離株菌液濃度調至108CFU/mL。 試驗組按0.1 mL/只腹腔注射菌液，對照組注射等量PBS后隔離飼養，觀察記錄發病及死亡情況直至第7天。死亡鴨及時剖檢并做細菌分離培養及PCR檢測。

1.2.6 生長曲線測定 挑取毒力較強以及2株毒力較弱分離株的單個菌落分別接種于10 mL LB培養基中，37 ℃培養過夜；將細菌懸液按照1∶100的比例接種至100 mL LB培養基，37 ℃ 200 r/min搖振培養，每隔1 h取200 μL細菌懸液測D600 nm值，連續12 h，進行生長曲線測定。

1.2.7 LD50測定 選取毒力強的鴨源大腸桿菌分離株，根據D600 nm值將細菌濃度調至109或108CFU/mL，10倍倍比稀釋至106或105CFU/mL進行LD50測定，再根據毒力強的鴨源大腸桿菌分離株的數量，將7日齡櫻桃谷鴨隨機分組，每組8只，每只腹腔接種0.1 mL菌液(對照組接種等量的PBS)，感染后觀察7 d，記錄雛鴨的死亡情況，并根據Reed-Muench方法[10]計算LD50。

1.3 數據統計

采用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析。本研究中生長曲線試驗進行雙尾獨立T檢驗，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 鴨源大腸桿菌分離鑒定

根據臨床癥狀共收集293份樣品，其中74份樣品在麥康凱培養基上生長出粉紅色、表面光滑、邊緣整齊的圓形菌落；74株分離株經特異性PCR鑒定，均擴增出720 bp的目的條帶(部分結果見圖1)，與預期片段大小一致。測序比對結果初步表明，74株分離株均為大腸桿菌。生化試驗結果表明，這些菌株均能發酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖產酸產氣；吲哚、MR實驗均為陽性；枸櫞酸鹽、VP為陰性；不產生H2S。說明分離到了74株大腸桿菌，總檢出率為25.26%，其中江蘇、江西以及安徽地區檢出率分別為45.26%、17.27%和13.64%。

M,100 bp DNA Marker;1～22，部分分離株;23,陽性對照;24,陰性對照M,100 bp DNA Marker;1-22,Partial isolates;23,Positive control;24,Negative control圖1 部分分離菌株PCR鑒定Fig.1 PCR identification of partial isolates

2.2 鴨源大腸桿菌血清學鑒定

74株鴨源大腸桿菌分離株經O血清型鑒定結果顯示，目的片段為263、355、459、623 bp的菌株分別有1、2、2、4株(圖2)，再通過玻板凝集實驗進行驗證，與PCR結果一致；剩余65株分離株因血清交叉凝結嚴重暫未定型。以上結果表明，O1血清型菌株為1株，占1.35%；O2血清型菌株為2株，占2.7%；O18血清型菌株為2株，占2.7%；O78血清型菌株為4株，占5.4%。

2.3 鴨源大腸桿菌毒力基因檢測

對74株鴨源大腸桿菌分離株進行18種毒力基因檢測，結果顯示，ibeB和yijp基因的檢出率最高，均為97.3%(72/74)；OmpA、mat、iucD和fimC基因的檢出率分別為95.95%(71/74)、90.54%(67/74)、78.38%(58/74)和77.03%(57/74)；papC、vat、cva/cvi和chuA基因均只有1個菌株檢測為陽性結果，檢出率均為1.35%(1/74)(圖3)，表明74株分離株毒力基因譜分布廣泛。

74株分離株均含有2種或者2種以上的毒力基因，最高可攜帶13種毒力基因，其中攜帶6種毒力基因的細菌數為26株，攜帶7種毒力基因的細菌數有18株(圖4)。

M,100 bp DNA Marker;1,O1血清型菌株;2、3,O2血清型菌株;4、5,O18血清型菌株;6～9,O78血清型菌株M,100 bp DNA Marker;1,Serotype O1 isolate;2 and 3,Serotype O2 isolates;4 and 5,Serotype O18 isolates;6-9,Serotype O78 isolates圖2 鴨源大腸桿菌分離菌株O血清型鑒定結果Fig.2 Identification of the serotype O of Escherichia coli isolates from ducks

圖3 74株鴨源大腸桿菌攜帶毒力基因統計結果Fig.3 Distribution of virulence genes in 74 strains of Escherichia coli isolates from ducks

圖4 毒力基因分布情況Fig.4 Distribution of 18 virulence genes

2.4 鴨源大腸桿菌致病性測定

74株鴨源大腸桿菌使用107CFU/只的劑量腹腔接種7日齡健康非免疫櫻桃谷鴨，雛鴨感染后，接種了分離株2019JS001和2019JS009的雛鴨于24 h開始出現精神萎靡，食欲減退，不愿飲水，逐漸消瘦，嗜睡，排黃白色糞便等癥狀，隨后部分雛鴨出現死亡；剖檢可見肝臟腫大，呈青銅色，部分雛鴨肝臟與心臟都有黃白色纖維素性滲出物，腹膜炎，腹部有滲出物，對照組雛鴨各方面均正常。各試驗組雛鴨感染鴨源大腸桿菌分離株后均有不同程度的發病，其中2株鴨源大腸桿菌(2019JS001、2019JS009)感染鴨的死亡率≥50%，說明其毒力較強。另外2株鴨源大腸桿菌分離株2019JS002、2019JS010感染鴨后，其癥狀較輕，死亡率為0，說明其毒力較弱。

2.5 生長曲線測定

將毒力較強的分離株2019JS001、2019JS009株以及2株毒力較弱分離株2019JS002、2019JS010經連續12 h生長曲線測定發現，其生長曲線均呈上升趨勢，且毒力較強和較弱分離株生長速度之間差異均不顯著(P>0.05)(圖5)，說明分離株2019JS001、2019JS009株的毒力較強與生長速度快慢無關。

同一時間不同菌株相比，無*，差異不顯著(P>0.05)Compared with different strains at the same time,no*，no significant difference (P>0.05)圖5 4株鴨源大腸桿菌的生長曲線圖Fig.5 The growth curve of 4 strains of Escherichia coli isolates from ducks

2.6 LD50測定

將菌株2019JS001、2019JS009培養至對數生長期，分別用PBS稀釋至最終接種劑量分別為108、107、106、105、104CFU和 109、108、107、106、105CFU，每個劑量分別接種8只雛鴨觀察7 d后，計算LD50分別為104.75和107.375CFU。

3 討 論

近期來，在水禽養殖過程中鴨源大腸桿菌引起的繼發性疾病較多，形勢嚴峻復雜[11]。本研究根據臨床癥狀共采樣293份，通過PCR以及生化鑒定出74株鴨源大腸桿菌，總檢出率為25.26%，其中江蘇、江西以及安徽地區檢出率分別為45.26%、17.27%和13.64%。

大腸桿菌血清型眾多，主要分為O、K、H、F 4種抗原，其中O抗原至少有173種[12]。中國西南地區以O76、O78、O92、O93為優勢血清型[13]；山東部分地區以O2、O21、O73、O78、O83、O119、O139血清型為主[14]；廣東地區優勢血清以O2、O20、O78、O86、O65為主[15]；因此不同地區的血清型具有地方特異性。國內外有研究表明，其中有50%的禽致病性大腸桿菌暴發病例主要與血清型O1、O2、O18、O78有關[6]。因此，本研究74株鴨源大腸桿菌主要對這4種血清型進行鑒定，結果表明O1血清型有1株，O2和O18血清型各2株，O78血清型有4株；其余菌株因大腸桿菌血清交叉凝結現象較嚴重，均未定型。

毒力基因是致病菌引起機體發病的重要因素，目前發現大腸桿菌的毒力基因主要包括黏附素、侵襲素、溶血素、鐵攝取系統、抗血清存活因子和空泡形成毒素等[16]。本研究74株分離株中，97.3%的菌株均檢測出侵襲性相關基因ibeB和yijp，這兩個基因是大腸桿菌侵襲腦血管內皮細胞相關的細菌毒力因子[17]，其次是OmpA基因(抗血清存活因子)和mat基因(黏附相關基因)，檢出率均>90%，iucD基因(攝鐵系統相關基因)和fimC基因(黏附相關基因)均>75%，這與福建[1]、河南[3]、河北[18]等地檢出的主要毒力基因不同，表明鴨源大腸桿菌流行的地區不同，攜帶的主要毒力基因也存在差異。74株分離株有12種毒力基因譜，其中攜帶6種和7種毒力基因的占59.46%，最高的攜帶13種毒力基因。由于禽致病性大腸桿菌毒力因子組成復雜，并且相互作用導致該病的暴發，因此，加強對鴨源大腸桿菌毒力基因的監測具有重要意義，有助于大腸桿菌病的防控，并且降低該病對水禽養殖業的危害。

雛鴨致病性試驗表明，74株分離株均有不同程度的致病性，經107CFU/只攻毒后，僅有2株大腸桿菌(2019JS001，2019JS009)感染鴨的死亡率≥50%，與李迎曉等[3]研究中的分離株致病性鑒定結果不同，這可能與不同地區分布不同以及血清型為O1、O2、O18、O78菌株較少有關[6]。隨后對2019JS001和2019JS009株進行LD50測定，其分別為104.75和107.375CFU，同時這2株分離株均為非O1、O2、O18、O78血清型菌株，18種毒力基因中分別鑒定出12和11種毒力基因譜，都攜帶tsh、mat、fimC、ibeB、yijp、OmpA、neuC、iss、iron和iucD基因，這與其他研究[19-20]表明致病性大腸桿菌的致病性與毒力基因密切相關，且毒力較強的菌株均攜帶4個以上毒力基因的結果一致。因此，加強對鴨源禽致病性大腸桿菌的血清型、毒力基因譜以及致病性的監測，可以對該病的預防控制以及研究三者之間的相互關系奠定基礎。

4 結 論

本研究根據臨床癥狀共采樣293份，通過PCR以及生化鑒定出74株鴨源大腸桿菌；其中O1、O2、O18和O78血清型分別有1、2、2和4株，其余菌株因大腸桿菌血清交叉凝結現象較嚴重，尚未定型；74株分離株有12種毒力基因譜，其中攜帶6和7種毒力基因占59.46%，最高攜帶13種毒力基因；動物致病性試驗表明，經107CFU/只攻毒后，74株分離株均引起雛鴨不同程度發病，但僅有2株分離株毒力較強，其LD50分別為104.75和107.375CFU。