多糖作為獸用疫苗佐劑作用機制的研究進展

史 茜，徐新峰，李學文，肖媛媛，白梅花，張富春

(1.新疆大學生命科學與技術學院，烏魯木齊 830046；2.烏魯木齊海關技術中心，烏魯木齊 830063)

多糖是由至少10個單糖分子脫水聚合而成的高分子碳水化合物，可形成直鏈或分支長鏈，結構復雜且龐大。多糖在自然界分布廣泛，從天然產物中分離出的多糖化合物多達數千種，根據其來源不同可分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖。多糖具有免疫調節、抗病毒、抗炎、抗氧化等多種功能活性[1]。天然來源的多糖具有毒副作用小、安全性高、功能多樣，并具有廣譜免疫調節作用等優點，臨床已有獲得獸藥證書的黃芪多糖和香菇多糖。

免疫佐劑是指一類能非特異性地增強或改變機體對匹配抗原的特異性免疫應答，增強抗原的免疫原性或改變免疫的反應類型，但其本身并無抗原性的一類物質[2]。常用獸用疫苗免疫佐劑按其成分及來源可分為油乳佐劑、無機佐劑、人工合成佐劑、生物性佐劑等。多糖促進免疫調節具有多靶點、多功能和多因子效應[3]，因此可廣泛用作獸用疫苗免疫佐劑。 筆者闡述了多糖作為免疫佐劑對免疫器官、免疫細胞、免疫分子作用的相關機制及多糖受體關系等內容。

1 多糖對免疫器官的促進作用

免疫器官分為中樞免疫器官和外周免疫器官。中樞免疫器官包括胸腺和骨髓及鳥類法氏囊，主要是免疫細胞發生、分化和成熟的場所，如法氏囊是B細胞誘導和分化的場所，胸腺則為T細胞誘導和分化的場所；外周免疫器官包括淋巴結、脾臟、黏膜相關淋巴組織，主要是成熟T細胞和B細胞定居的場所，也是免疫細胞在抗原刺激下發生免疫應答的部位。多糖通過刺激免疫器官自身的細胞生長發育和分裂增殖，導致免疫器官重量或指數的增加，從而達到增強免疫反應的作用[4]。金絲小棗多糖(Ziziphusjujubapolysaccharide,ZJP)可顯著提高環磷酰胺(cyclophosphamide,Cy)導致的免疫抑制蛋雛雞胸腺和法氏囊指數，可顯著緩解環磷酰胺導致的臟器萎縮[5]。脾臟是動物最大的外周淋巴器官，富含多種免疫細胞，脾臟增殖代表著動物免疫系統的增強[6]。黃芪多糖(Astragaluspropinquuspolysaccharide,APS)能使小鼠、豬和海蘭褐雛雞的脾臟指數提高，同時提高胸腺及法氏囊等免疫器官的重量[7]，云芝中提取的蛋白結合多糖K作為卵清蛋白(oval bumin,OVA)p323-339疫苗佐劑可導致引流淋巴結腫大，淋巴結中細胞總數升高，CD11c+樹突細胞(dendritic cell,DC)的百分比和數量顯著增加，并上調CD80、CD86、主要組織相容性復合體Ⅱ類(MHCⅡ)和CD40的表達量，從而促進樹突細胞的活性增加[8]。

2 多糖對免疫細胞的作用

多糖通過調節多種免疫細胞的活性發揮佐劑作用,其能通過增強巨噬細胞吞噬能力和自然殺傷細胞(NK細胞)的殺傷能力調節固有免疫反應；通過提高樹突細胞的抗原遞呈能力，從而誘導T淋巴細胞亞群(Th1、Th2、Th17、Treg和細胞毒性T淋巴細胞(CTL細胞))的分化并誘導B淋巴細胞產生特異性抗體，激活適應性免疫反應；通過刺激細胞因子白細胞介素(interleukin,IL)、干擾素(interferon,IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)、轉化生長因子(transforming growth factor,TGF)等的產生發揮免疫調節作用(圖1)。

圖1 多糖對免疫細胞的作用機制Fig.1 Mechanism of polysaccharide on immune cells

2.1 增強巨噬細胞吞噬活性及抗原遞呈能力

巨噬細胞作為固有免疫的組成部分，在應對病原體感染時起到吞噬作用，同時其也是一類抗原遞呈細胞，參與機體的細胞免疫和體液免疫。 多糖作為疫苗佐劑，可改變巨噬細胞的體積，增強巨噬細胞的吞噬能力，促進NO和細胞因子分泌，增強酶活性[9-11]。 以五味子多糖(Schisandrachinensispolysaccharide,SCP)為佐劑，聯合畢赤酵母表達的鴨IgY Fc與鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白A(OmpA)的融合蛋白OmpA-Fc進行免疫，對雛鴨的免疫應答具有明顯的調節作用，能顯著增強巨噬細胞的吞噬功能，提高血清抗體滴度、增加CD4+T細胞和CD8+T淋巴細胞數量、促進淋巴細胞轉化率和血清IL-2和IL-4水平[12]。多糖佐劑也可增強巨噬細胞的抗原遞呈能力，將仙茅多糖(Curculigoorchioidespolysaccharide)與流感疫苗同時注射免疫昆明小鼠，免疫3 d后提取各組小鼠腹腔巨噬細胞，經流式細胞儀檢測顯示，不同濃度的仙茅多糖均可促使腹腔巨噬細胞表面CD80、CD86和小鼠MHCⅡ出現不同程度的表達上調[13]。

2.2 增強NK細胞殺傷能力

NK細胞通過免疫調節作用，可增強宿主對病毒、細菌和某些寄生蟲的抵抗力，并具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力[14]。多糖可通過調節NK細胞的細胞毒性、促進細胞因子及免疫調節介質的產生發揮佐劑功能。通過人參多糖(Panaxginsengpolysaccharide,GPS)對環磷酰胺免疫抑制的小鼠NK細胞毒性的研究發現，人參多糖能增加全血中NK細胞的數量，上調穿孔素和顆粒酶的表達，促進免疫抑制小鼠NK細胞的細胞毒性[15]。多糖可激活NK細胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-12和TNF-α等細胞因子，IFN-γ能增強NK細胞的活性，并促進原始Th細胞分化為Th1細胞。IL-12通過刺激NK細胞形成穿孔素，介導腫瘤和病毒感染細胞的凋亡[16]。使用黃芪多糖與雞OVA經皮下免疫C57BL/6 小鼠，末次免疫7～14 d后，檢測免疫小鼠血清和脾臟發現，黃芪多糖組小鼠OVA特異性抗體含量明顯高于OVA組小鼠，但小鼠脾臟內NK和NKT細胞的百分比含量與OVA組和正常小鼠差別不大。經PI刺激后，黃芪多糖組小鼠脾臟內NK細胞中IL-4+細胞明顯高于OVA組和正常組，且IFN-γ+細胞的比例明顯下降；雖然經過PI刺激以后黃芪多糖組小鼠脾臟內NK細胞中IL-4+細胞升高不明顯，但IFN-γ+細胞的比例明顯下降[17]。

2.3 促進樹突細胞的成熟和分化

樹突細胞是一種抗原遞呈細胞，能捕獲、加工并遞呈抗原給淋巴細胞以啟動和調節適應性免疫反應。樹突細胞成熟是誘導適應性免疫的關鍵，未成熟的樹突細胞具有較強的內吞抗原能力，在多種刺激條件下向成熟樹突細胞轉化，使樹突細胞表面共刺激分子(CD40、CD80和CD86)及MHC分子的表達量增加，刺激T淋巴細胞的活化及分化，同時增加促炎細胞因子分泌，促進免疫反應沿著特定的方向發展[18]。多糖通過促進樹突細胞的成熟和分化，增強機體對抗原的攝取能力，從而發揮免疫佐劑效應。 川明參多糖(Chuanminshenviolaceumpolysaccharide,CVP)作為口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)疫苗佐劑，可增強樹突細胞上CD40、CD80和CD86的表達，上調MHC Ⅰ/Ⅱ、TLR-2/4的mRNA水平，同時下調轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β) mRNA表達，下調CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞的頻率，表明CVP可通過TLR-2和TLR-4信號通路發揮免疫佐劑的效果[19]。黃芪多糖作為乙型肝炎(HBV)DNA疫苗的佐劑免疫小鼠，能顯著增強特異性抗體水平的產生，促進T細胞的增殖，誘導CD4+T細胞及CD8+T細胞產生相關細胞因子，并誘導殺傷性T細胞活化，促進樹突細胞成熟，同時抑制TGF-β表達和Treg細胞頻率[20]。多糖被證實具有黏膜佐劑的作用，地黃多糖(Rehmanniaglutinosapolysaccharide,RGP)作為黏膜免疫佐劑，滴鼻免疫C57BL/6小鼠，可誘導小鼠縱隔淋巴結(mediastinal lymph-nodes,mLN)中C-C基序趨化因子受體7(CC-chemokine receptor 7,CCR7)上調，使樹突細胞數量顯著增加，并上調mLN-Dc中共刺激分子的表達和肺泡內促炎細胞因子的濃度，誘導mLN中T細胞產生IFN-γ和TNF-α[21]。

2.4 促進T淋巴細胞增殖

T淋巴細胞亞群是評價細胞免疫的關鍵指標，多糖通過影響T淋巴細胞的數量、比例和形態從而發揮免疫佐劑的作用。多糖佐劑功能研究較多的細胞亞群主要包括CD4+T細胞、CD8+T細胞及Treg細胞等。CD4+T細胞，即輔助性T細胞，包括Th1細胞和Th2細胞，具有輔助細胞免疫和體液免疫的功能。CD8+T細胞，即CTL細胞，其主要作用是殺死感染了病原體的宿主細胞和破壞腫瘤細胞[22]。Treg細胞具有負向免疫調節能力，可以抑制免疫系統的功能和免疫細胞活性[23]。黃芪多糖和白花蛇舌草(Hedyotisdiffusa)多糖作為免疫增強劑聯合高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)滅活疫苗免疫仔豬,均能顯著提高仔豬CD3+、CD4+、CD8+淋巴細胞的百分比和特異性抗體滴度[24]。一枝蒿(ArtemisiarupestrisL.)多糖作為FMDV疫苗佐劑免疫小鼠，增加了CD4+CD44+和CD8+CD44+有效T細胞的水平，同時顯著增加了FMDV免疫小鼠脾細胞的CTL反應[25]。 肉蓯蓉(Cistanchedeserticola)水提物作為多糖佐劑聯合季節性流感疫苗(IVV)可促進淋巴細胞增殖，提高引流淋巴結和脾臟CD4+T細胞、CD8+T細胞和CD44+T細胞的陽性率，誘導Th1型免疫應答，同時伴有CD4+T細胞和CD8+T細胞IFN-γ的誘導，激活樹突細胞，降低Treg細胞的表達[26]。

2.5 促進B淋巴細胞增殖

B淋巴細胞主要參與體液免疫反應，在抗原刺激下可轉化為效應B細胞(漿細胞)，合成免疫球蛋白，能與靶抗原結合的免疫球蛋白即為抗體。多糖作為佐劑可刺激B淋巴細胞的增殖。將茯苓多糖-Ⅱ(Poriacocospolysaccharide Ⅱ,PCP-Ⅱ)與滅活狂犬病病毒RCVS-11-G通過肌內注射小鼠后，對小鼠病毒中和抗體效價的提高有促進作用，還可激活腹股溝淋巴結中B淋巴細胞的增殖，激活血液中的B淋巴細胞和T淋巴細胞，刺激脾細胞分泌IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ[27]。磷酸化川牛膝多糖(pRCPS)作為FMDV疫苗佐劑可上調FMDV特異性IgG、IgG1、IgG2b和IgG2a抗體水平和脾細胞增殖[28]。記憶性B細胞具有再次暴露于抗原時迅速增殖分化為漿細胞并分泌抗體的能力。PCP-Ⅰ可顯著提高炭疽菌特異性抗PA抗體、毒素中和抗體、抗PA抗體親和力，以及IgG1和IgG2a水平。PCP-Ⅰ可增加PA特異性記憶B細胞的頻率，增加PA特異性脾細胞的增殖，顯著刺激IL-4的分泌，增強樹突細胞的活化[29]。

3 多糖對免疫分子的作用

3.1 刺激細胞因子的產生

細胞因子在功能性免疫系統的發育和機體對感染的反應中都起著重要作用。多糖刺激細胞產生的細胞因子按功能劃分為Th1型細胞因子(IL-2、IL-12、IFN-γ和TNF-β等)與Th2型細胞因子(IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等)[30]。Th1細胞主要促進細胞介導的免疫，而Th2細胞以促進抗體產生為主[31]。常用的鋁佐劑只能誘導Th2型免疫應答，理想的佐劑應能同時誘導Th1型及Th2型的免疫反應。由表1可知，許多多糖佐劑能刺激機體產生IL、IFN、TNF、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)等細胞因子，通過使免疫反應向Th1/Th2型免疫反應改變，從而改變疫苗的免疫特性。

3.2 促進抗體的產生

抗體是B淋巴細胞在抗原刺激后增殖分化為漿細胞所產生的免疫球蛋白。抗體可特異性地與抗原結合，發揮免疫作用。哺乳動物免疫球蛋白分為IgG、IgM、IgA、IgE及IgD。IgG是血清中含量最多的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、抗毒素等特性，對毒性產物起中和、沉淀、補體結合作用，IgG1滴度可反映Th2免疫反應的強度，IgG2a、IgG2b和IgG3抗體滴度可反映Th1免疫反應的強度。IgA主要由呼吸道、胃腸道、泌尿生殖道等處黏膜固有層中的漿細胞合成，是機體黏膜防御感染的重要因素[33]。IgM是機體被感染后最先出現的抗體，具有強有效的病毒清除作用[36]。多糖佐劑可誘導IgG、IgA、IgM等抗體的生成，發揮特異性的免疫作用(表1)。

4 多糖相關受體及信號通路

多糖作為獸用疫苗佐劑，不僅能促進抗原特異性免疫系統，還能增強機體的自然免疫功能，通過對先天性免疫反應的激活，產生刺激和引導隨后的適應性免疫反應信號，從而發揮佐劑作用。 多糖通常是以病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMP)識別免疫細胞上的模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)，進而活化免疫細胞，促進細胞因子的釋放，介導機體免疫反應[38]。多糖作為配體主要與Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR)、C型凝集素受體(C-type lectin-like receptor，CLR)、補體受體3(complement receptor 3,CR3)、清道夫受體(scavenger receptor,SR)等受體分子結合[39]。

4.1 TLR

TLR是主要在宿主抗原提呈細胞(APCs)中表達的PRRs，并在決定致病性感染中發揮關鍵作用。TLR家族的10個成員(TLR1～TLR10)中能與多糖相互作用的TLRs主要是TLR4和TLR2。

4.1.1 TLR4 TLR4是目前研究最廣泛的一類PRRs，它不僅在免疫細胞如巨噬細胞、中性粒細胞、樹突細胞中表達，還表達于內皮細胞、心肌細胞等多種細胞中。其配體包括革蘭氏陰性菌的脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)、脂寡糖、細菌內毒素和病毒、真菌和霉菌分泌物質[40]。其介導的植物多糖糖鏈主要由α-(1→3)和α-(1→6)構型組成，通過介導髓樣分化因子88(myeloid differentiation factor 88,MyD88)依賴與非依賴兩種途徑，促進核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)、 絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)的激活，進而促進IL-1、IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子的產生[41]，從而產生強有力的炎癥反應。

4.1.2 TLR2 TLR2常表達于巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞等抗原遞呈細胞的表面，能識別多種病原體，是識別范圍最廣的TLR，其配體有革蘭氏陽性菌的脂蛋白、肽聚糖(peptidoglycan,PGN)、脂磷壁酸(lipteichoic acid，LTA)、阿拉伯甘聚糖(lipoarabinomannan，LAM)、酵母聚糖(zymosan)等[42]。TLR2可與大部分配體直接結合誘導免疫應答，但對PGN的識別還需要TLR1與TLR6的參與[43]。TLR2介導的植物多糖的糖鏈主要由α(1→3)或β(1→4)構型組成，通過MyD88依賴途徑激活NF-κB或磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinases,PI3K)/蛋白質絲氨酸蘇氨酸激酶(protein-serine-threonine kinase,AKT)信號通路通路，導致IRF3、IRF7、AP-1和NF-κB等促炎因子的磷酸化和激活，發揮抗菌、抗病毒和抗腫瘤的作用[44]。

4.2 CLR

CLR是一個大的蛋白超家族，具有一個或多個相關的C型凝集素樣結構域(CTLDs)。CLR具有Ca2+依賴性，通過其碳水化合物識別域(carbohydrate recognition domain,CRD)識別多糖[45]。 識別的多糖主要含有α-(1→3)、α-(1→4)、β-(1→3)和β-(1→4) 型的糖苷鍵。CLR中主要作用于多糖的受體包括甘露糖受體(mannose receptor,MR)、Dectin-1、Dectin-2、Dectin-3等。

4.2.1 MR MR屬于鈣依賴性Ⅰ型跨膜蛋白受體。MR既能識別巨噬細胞、內皮細胞和樹突細胞等細胞表達的內源性分子，又能識別病原體，它是連接固有免疫和適應性免疫之間的橋梁。MR識別的配體主要有L-巖藻糖、D-甘露糖和D-N-乙酰葡萄糖胺等[46]。MR通過胞外結構域識別和結合許多內源性配體，通過內吞作用和吞噬作用將其內化和降解，從而維護內環境的穩定[47]。MR需其他受體共同參與完成信號轉導，激活轉錄，促進IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、GM-CSF、IL-10等細胞因子的表達，發揮免疫防御、免疫穩定、免疫監視的功能[48]。

4.2.2 Dectin-1 Dectin-1受體是一種Ⅱ型CLR，主要介導具有β-(1→3)和β-(1→6)構型的葡聚糖配體，被稱為β-葡聚糖受體。因β-葡聚糖是真菌細胞壁的主要成分，所以Dectin-1受體也可作為真菌的主要模式識別受體。Dectin-1存在于髓系細胞上，包括巨噬細胞、樹突狀細胞和中性粒細胞，它也存在于某些淋巴細胞上，如γδT細胞[49]。 Dectin-1介導的下游信號通路分為脾酪氨酸激酶(spleen tyrosine kinase,Syk)的NF-κB信號通路和非Syk的NF-κB通路，以及其他與Dectin-1受體下游信號相互作用的通路[50]。Dectin-1也可增強TLR4及TLR2介導的信號傳導，促進細胞因子分泌。這誘導了多種細胞反應，包括呼吸爆發、磷脂酶A2(PLA2)和環氧化酶2(COX2)的激活和調節、內吞和吞噬的配體攝取及多種細胞因子和趨化因子的產生，包括TNF、巨噬細胞炎癥蛋白2(MIP-2)、IL-2、IL-10、IL-6和IL-23。

4.2.3 Dectin-2與Dectin-3 Dectin-2是一種Ⅱ型CLR，廣泛存在于巨噬細胞上。 最初鑒定Dectin-2所識別的多糖均含有甘露糖成分，含ITAM的銜接蛋白(如FcRγ)相互作用，誘導多個信號轉導級聯，然后通過Syk和CARD9依賴途徑激活NF-κB，誘導Th17的分化，細胞因子如TNF-α、IL-2、IL-10、IL-23、IL-1β、IL-6和IL-12等介導機體免疫應答[51]。Dectin-3能識別某些真菌的α-甘露聚糖，與Dectin-2分子的作用機制相同[52]。

4.3 CR3

在免疫系統的細胞中，最豐富的補體受體是CR3。CR3屬于黏附分子整合素家族中的成員，是最重要的吞噬受體之一，主要與β-葡聚糖結合。CR3在單核細胞、巨噬細胞、粒細胞、NK細胞及T淋巴細胞和B淋巴細胞的某些亞群上表達[53]。 CR3介導的活化需要黏附斑激酶(focal adhesion kinase,FAK)、Syk、PI3K、Akt、p38MAPK、磷脂酶C(phospholipaseC,PLC)和蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)，可使NK細胞、巨噬細胞、中性粒細胞處于預激活化狀態，然后通過補體iC3b的紐帶作用使效應細胞和靶細胞相互結合，殺傷靶細胞[54]。

4.4 SR

SR主要表達于巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞、小膠質細胞和B淋巴細胞上，同時也在內皮細胞和上皮細胞中表達。 SR最初是根據它們結合修飾的低密度脂蛋白(LDL)的能力來識別和分類的，根據其序列相似性或共同的結構特征被分為A～J 10類，具有結合LPS和磷脂酰絲氨酸的能力。SR具有廣泛的功能，如清除病原體、凋亡細胞清除、脂質運輸、細胞黏附、細胞內貨物運輸，甚至是味覺感知。SR所識別的多糖可具有α-和β-構型，通過激活PLC，隨之激活 PKC和P13K，導致 MAPK、ERK 及NF-κB 激活，致使下游相關基因表達[55]。

由表2可知，不同多糖因其結構和組成不同，所結合的受體種類和其作用機制也不相同。

5 小結與展望

目前獸用疫苗中主要依賴鋁佐劑或油佐劑，多糖作為植物來源天然產物具有毒性低、副作用小等優點，作為疫苗佐劑具有廣泛的應用前景。近些年人們對多糖進行了廣泛的研究，但只有少數可實際應用于臨床中，主要是因為多糖具有純度低、質量標準不易控制、分子結構不明確、影響其生物活性因素多、具有量效關系等缺點，從而限制了其應用。今后多糖的研究趨勢主要以廣泛篩選可應用的天然多糖并開展佐劑效果評價，對其佐劑機制進行深入研究，與其他佐劑配伍作用的可能性與作用機制的研究，以及對其結構的解析和構效關系的研究等內容著手，深入系統地研究多糖的佐劑作用，使人們從更多的角度認識并應用多糖。