1株黃曲霉頡頏菌的鑒定及其抑菌活性成分分析

李天溪，黨 萌，龍 淼

(沈陽農業大學動物科學與醫學學院，重要家畜疫病研究教育部重點實驗室，沈陽 110161)

黃曲霉(Aspergillusflavus)作為曲霉屬真菌能通過產生分生孢子的方式污染多種農作物，可導致花生黃霉病、玉米穗腐病[1]等多種常見的植物病害。其在受到刺激(如高溫、干旱)時產生的黃曲霉毒素[2]是造成食品及飼料污染的主要原因[3]。人畜誤食污染的農副產品會感染具有高發病率和死亡率的曲霉病，出現呼吸衰竭或神經麻痹等癥狀[4-5]，給人們帶來巨大的經濟損失和安全隱患。但常見的物理化學等防治方法又存在藥物殘留等諸多弊端。近年來，生物防治因其專一性、環境友好性、易于產業化等優勢逐漸成為熱點[6]。生防菌的篩選鑒定為安全有效地抑制黃曲霉污染提供了可能[7]。解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)可頡頏多種導致植物患病的致病真菌[8-9]，其不僅能抑制黃曲霉的生長，對黃曲霉產生的黃曲霉毒素也有很好的降解效果[10]，是一種很有開發前景的生防菌。基于此，本試驗嘗試從試驗室保存的若干菌株中篩選鑒定黃曲霉頡頏菌，以期為實際生產應用中通過生物防治方法安全有效地抑制黃曲霉污染提供理論依據。

生防菌對真菌的頡頏作用多源自于其代謝產生的抗菌活性物質[11-12]，這些物質主要是存在于菌株無菌發酵上清液中的酶、抗生素、細菌素或其類似物及一些次生代謝產物和副產物。通過代謝工程或優化頡頏菌的培養條件可使頡頏菌高水平產生抑菌活性物質，從而產生更好的抑菌效果[13-15]。本研究對菌株培養條件進行了探索，并分離頡頏菌抗真菌活性成分，以期為進一步研究抗菌機制和量產應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

74種供試菌株由沈陽農業大學動物醫學與科學學院臨床教研實驗室保存。

黃曲霉產毒菌株購自中國科學院微生物研究所(編號：3.4408)。孢子懸液的制備：黃曲霉菌通過高鹽查氏培養基37 ℃培養72～96 h充分形成孢子。刮取孢子到裝有滅菌水和數顆玻璃珠的錐形瓶中混合振蕩1.5 h，活化并分散孢子。紗布過濾后制成單孢子懸液，通過血球計數板計數調整濃度至107CFU/mL。

1.2 主要試劑及儀器

革蘭氏染色劑購自杭州濱和微生物試劑有限公司；核酸染色劑(GoldView)、50×TAE、考馬斯亮藍R-250、Tris、硫酸銨均購自北京索萊寶科技有限公司；細菌基因組總DNA提取試劑盒、TaqPCR 2×Master Mix均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；PBS購自武漢賽維爾生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司。

AB104-S型分析天平購自Mettler Toledo公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺購自蘇州安泰有限公司；DHP-9162恒溫培養箱購自上海一恒科學儀器有限公司；高速冷凍離心機購自Thermo Fisher Scientific公司；凝膠成像儀、PCR儀、電泳儀均購自Bio-Rad公司；細菌過濾器(0.22 μm)購自白鯊生物科技有限公司；顯微鏡購自Leica公司；HiTrap Capto DEAE色譜柱(5 mL)；SuperdexTM75 Increase 10/300 GL色譜柱和KTA蛋白純化系統均購自Cytiva公司。

1.3 培養基

根據文獻[16]配制GAM液體/瓊脂培養基、高鹽查氏培養基、PDA培養基、LB培養基、LA培養基、NA培養基、SYP培養基、MRS培養基。

1.4 方法

1.4.1 黃曲霉頡頏菌篩選 在PDA培養基中加入一定量配好的黃曲霉孢子懸液搖晃混勻制備固體平板，挑取供試菌單菌落用“十字劃線法”劃板，28 ℃培養72 h，以未接菌平板為空白對照，對黃曲霉頡頏菌進行初篩。

初篩通過的菌株在GAM液體培養基增菌24 h，菌液離心并濾掉菌體后取1 mL注入PDA培養基中制備固體平板。在平板中間打孔并注入25 μL黃曲霉孢子懸液，28 ℃培養72 h，以無菌空白培養基代替上清液為對照，對黃曲霉頡頏菌進行復篩。

測量黃曲霉生長直徑，用抑菌率表示頡頏菌無菌上清液的抗菌效果。每個處理重復3次，取平均值作為測定結果。抑菌率計算公式：

抑菌率(%)=(對照組直徑-試驗組直徑)/對照組直徑×100%

1.4.2 黃曲霉頡頏菌鑒定 將菌株接種于LB固體培養基上培養24 h，觀察其菌落形態特征并取樣進行革蘭氏染色，于顯微鏡下觀察菌體形態。應用《常見細菌系統鑒定手冊》所述方法及鑒定程序對菌株進行生理生化鑒定。

通過基因測序的方法對菌株進行分子生物學鑒定。應用細菌DNA提取試劑盒提取頡頏菌DNA，采用16S rDNA與gyrB基因組合的方式，通過PCR擴增相應序列。16S rDNA上、下游引物為F27：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R1492：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。gyrB基因上、下游引物為UP-1SF：5′-ATTGGTGACACC-GATCAAACA-3′；UP-2SR：5′-TCATACGTAT-GGATGTTATTC-3′。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系均為50 μL：TaqPCR Master Mix 25 μL，DNA 模板4 μL，上、下游引物各2 μL，ddH2O 17 μL。PCR反應條件：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共33個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存30 min。將PCR產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。在GenBank數據庫中使用BLAST程序分別對所得的16S rDNA和gyrB基因序列進行比對。應用DNAStar及Mega 7.0軟件進行相似性分析及系統發育樹構建。

1.4.3 頡頏菌最佳培養條件測定 通過單因素試驗，在不同的培養基(NA、LA、MRS和SYP)、培養基裝液量(15、30、40、50、75和100 mL)、溫度(10、20、30、37、40和50 ℃)、轉速(10、60、120、140、180和240 r/min)、培養時間(12、24、36、48 和60 h)、接種量(1%、2%、3%、4%和5%)及pH (5.0、6.0、7.0、8.0和9.0) 7個培養條件條件下培養頡頏菌制備菌液。按照復篩的操作及計算抑菌率的方法驗證菌液作用效果。

1.4.4 抗真菌活性粗提物對黃曲霉作用的評價 參考文獻[17]采用硫酸銨沉淀法對頡頏菌無菌發酵上清液進行粗提取：菌株活化后以1%接菌量接種于 LB 培養基，37 ℃、150 r/min震蕩培養3 d后4 ℃、9 000 r/min離心15 min取上清液。向其中加入硫酸銨至其飽和度為50%，4 ℃過夜。之后4 ℃、13 000 r/min離心15 min，用適量PBS緩沖液收集沉淀。透析過濾得到蛋白粗提液。

觀測粗提物對黃曲霉菌絲生長、重量及形態的影響。 PDA平板中央打孔注入黃曲霉孢子懸液，在距孔2 mm處放置滴加粗提物的濾紙片，用等量50%硫酸銨溶液處理的濾紙片作對照，觀察菌絲生長情況。再在其中挑取正常生長的和受抑制的菌絲分別做成切片并用棉蘭染色，在顯微鏡下觀察其形態結構的差異。另外，分別將0、400、800和1 000 μL粗提物加入含有黃曲霉孢子混懸液的PDA培養基中，28 ℃培養5 d后過濾菌體并烘干稱重。

1.4.5 抗真菌蛋白的分離純化及其活性評價 通過陰離子交換色譜初步純化。按上述方法制備粗提液并將其裝載到HiTrap Capto DEAE色譜柱上，用線性濃度梯度為0.01～2.0 mol/L的Tris-NaCl(pH 8.0)緩沖液以1 mL/min的流速洗脫，按照吸收峰的不同分別收集洗脫液。制備含有黃曲霉孢子的PDA固體平板并打孔，分別注入不同組分的洗脫液每孔50 μL，以滅菌水作對照，37 ℃培養過夜，評估各組分抗真菌活性。

之后通過凝膠過濾色譜進一步純化抑菌效果好的組分。將待測液裝載到SuperdexTM75 Increase 10/300 GL色譜柱上，用緩沖液(含20 mmol/L Tris，50 mmol/L NaCl,pH 8.0)以0.2 mL/min的流速洗脫，按照吸收峰的不同分別收集洗脫液。按上述方法檢測各組分抑菌情況。

1.4.6 抗真菌蛋白氨基酸序列測定 各組抗菌蛋白通過SDS-PAGE得到蛋白條帶。結合抑菌情況進行分析，選取相應的條帶交由北京華大蛋白質研發中心有限公司進行質譜測序鑒定。通過BLAST程序與NCBI蛋白序列數據庫中相應序列進行比對，初步判斷所得抗菌蛋白的種類及功能。

2 結 果

2.1 頡頏菌的篩選

初篩結果顯示，有5株菌可抑制黃曲霉生長并形成抑菌帶(圖1),復篩后發現，僅編號為B10的菌株對黃曲霉有明顯頡頏效果(圖2)，黃曲霉直徑平均值為3.15 cm，對照組為5.21 cm，抑菌率達到39.54%。證明菌株B10抑制了黃曲霉的生長。

圖1 黃曲霉頡頏菌初篩結果Fig.1 Preliminary screening results of antagonistic strains of Aspergillus flavus

A，對照組；B，試驗組A，Control group;B，Experimental group圖2 黃曲霉頡頏菌復篩結果Fig.2 Rescreening results of antagonistic strains of Aspergillus flavus

2.2 頡頏菌的鑒定

培養24 h后，平板表面長出一個個微隆起的白色圓形菌落，表面粗糙有褶皺，直徑3～4 mm(圖3)。由圖4和表1可知，菌株B10是一種能產生孢子的、圓桿狀革蘭氏陽性好氧細菌，接近芽孢桿菌屬。

以通用引物進行PCR擴增，獲得1條1 500 bp左右的16S rDNA序列和1條1 000 bp左右的gyrB基因序列(圖5)。通過序列比對及相似性分析發現，菌株B10與解淀粉芽孢桿菌GD4a(HM055603.1)的16S rDNA序列相似性為98.5%，在同一分支(圖6、7)；與解淀粉芽孢桿菌JX014631.1在同一分支且gyrB基因序列相似性為99.8%(圖8、9)。可確定此菌為解淀粉芽孢桿菌，保藏在中國微生物菌種保藏中心(保藏號CCTCCNO:M2018353)。

2.3 頡頏菌最佳培養條件的測定

不同培養條件下菌株B10對黃曲霉的抑制效果存在差異。由圖10A可知，以LA為培養基培養的菌株B10抑菌率最高，達到46.56%，后續試驗均以LA為培養基。由圖10B可知，40 ℃時得到最高抑菌率32.84%，其他溫度下抑菌率低或幾乎不抑制。由圖10C可知，培養36 h效果最好，抑菌率達到31.53%，其他時間對應的抑菌率由高到低排序為60 h>48 h>24 h>12 h。由圖10D可知，在接菌量到達3%前，接種量越大抑菌效果越好，最高抑菌率達到28.15%,之后迅速下降，抑菌效果極微弱。由圖10E可知，pH為6.0和7.0時抑菌效果均較好，抑菌率分別為28.85%和26.53%。由圖10F可知，120 r/min的抑菌效果最好，抑菌率為26.46%。由圖10G可知，裝液量為30 mL時抑菌率高達29.37%。

圖3 菌株B10菌落形態Fig.3 Colony morphology of strain B10

圖4 菌株B10革蘭氏染色結果(1 000×)Fig.4 Gram staining result of strain B10 (1 000×)

表1 菌株B10生理生化鑒定結果

1,陰性對照；2，16S rDNA；3，gyrB基因；M，DL2000 DNA Marker1，Negative control；2，16S rDNA；3，gyrB gene;M，DL2000 DNA Marker圖5 16S rDNA及gyrB 基因PCR產物電泳圖Fig.5 Electropherogram of 16S rDNA and gyrB gene PCR products

圖6 菌株B10的16S rDNA序列相似性分析Fig.6 Similarity analysis of 16S rDNA sequence of strain B10

圖7 菌株B10與參考株基于16S rDNA序列的的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain B10 and reference strains based on 16S rDNA sequence

圖8 菌株B10的gyrB基因序列相似性分析Fig.8 Similarity analysis of gyrB gene sequence of strain B10

圖9 菌株B10與參考株基于gyrB基因序列的的系統發育樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain B10 and reference strains based on gyrB gene sequence

A,培養基；B,培養溫度；C,培養時間；D,接種量；E,初始pH；F,轉速；G,培養基裝液量A,Culture medium；B,Culture temperature；C,Culture time；D,Inoculation amounts；E,Initial pH；F,Rotating speed；G,Culture medium volume圖10 不同培養條件下菌株B10對黃曲霉的抑菌率Fig.10 Bacteriostatic rate of strain B10 against Aspergillus flavus under different culture conditions

2.4 粗提物對黃曲霉菌絲的影響

由圖11可知，粗提物的添加抑制了黃曲霉的正常生長，形成了抑菌帶，使菌株呈“方塊”型，而對照組黃曲霉生長正常,證明粗提物對黃曲霉有抑制效果。

顯微鏡下菌絲形態見圖12。由圖12可知，正常黃曲霉的菌絲較筆直，孢子為規則的圓形或橢圓形。而粗提物作用下的黃曲霉菌絲則呈不規則彎曲狀，菌絲體粗細不一。表明粗提物對黃曲霉菌絲形態造成了嚴重破壞，影響黃曲霉生長發育。

對菌絲干重的測定結果見圖13。由圖13可知，隨著粗提物含量的增加，黃曲霉菌絲重量呈明顯下降趨勢。 未經處理的菌絲干重為3.20 g，當粗提液加入量達1 000 μL時，菌絲的重量減少到0.13 g，同比減少了96.05%。

A，對照組；B，粗提物組A，Control group；B，Crude extract group圖11 抗真菌活性粗提物對黃曲霉菌的作用效果Fig.11 Effect of crude extract with antibacterial activity on Aspergillus flavus

A,正常菌絲形態；B，粗提物作用下的菌絲形態A,Normal mycelial morphology;B,Mycelial morphology under the action of crude extract圖12 抗菌活性粗提物對黃曲霉菌絲形態的影響(400×)Fig.12 Effect of crude extract of antibacterial activity on the morphology of Aspergillus flavus mycelia (400×)

圖13 抗菌活性粗提物對黃曲霉菌絲干重的影響Fig.13 Effect of crude extract with antibacterial activity on the dry weight of Aspergillus flavus mycelium

2.5 抗真菌蛋白的分離純化及活性評價

粗提物經過陰離子交換色譜得到具有5個峰的洗脫曲線(圖14)。各組分抑菌結果顯示，培養12 h后，5個蛋白組中2、3號峰出現明顯抑菌圈且直徑較大，分別為1.52和1.23 cm。5號峰也出現抑菌圈，相較2、3號小，平均直徑為0.81 cm，但其抑菌圈內最干凈，抑菌帶邊緣最清晰。其他組分無抑菌效果。培養2 d后再次觀察發現，除5號峰外，其余各組分抑菌圈均消失(圖15)。

凝膠過濾色譜進一步純化組分5，得到的洗脫峰曲線見圖16。各組分抑菌結果顯示，7個蛋白組中，只有5-2和5-3出現清晰且明顯的抑菌圈，平均直徑分別為1.21和1.08 cm，且后續抑菌圈不消失(圖17)。其余5個組分均無顯著抑菌效果。

2.6 蛋白測序分析

通過SDS-PAGE制得組分5蛋白條帶，結合抑菌情況，選取組分5-2和5-3蛋白條帶送測序。返回數據與蛋白質序列數據庫中相應序列進行比對，得到一系列蛋白鑒定信息。整理數據并查閱相關文獻之后，羅列了5-2和5-3中存在抗真菌可能性的8種蛋白(表2)。

圖14 陰離子交換結果Fig.14 Anion exchange results

圖15 組分5的抑菌效果Fig.15 Antibacterial effect of component 5

圖16 組分5純化結果Fig.16 Purification results of component 5

圖17 5-2和5-3的抑菌效果Fig.17 Antibacterial effect of 5-2 and 5-3

表2 存在抗真菌可能性的蛋白

3 討 論

生防菌的篩選鑒定一直是生物防治的重要方法之一。本試驗篩選出的解淀粉芽孢桿菌是畜禽養殖中常見的益生菌[18]，在防治農作物病害上也有十分廣泛的應用[19]。很多取得專利的生防菌及抑菌劑均與其相關[20-21]，且其產生的次級代謝產物也有成為抗菌藥物的潛力[22]。

頡頏菌的培養條件往往會對其抗菌效果產生重要影響。同為解淀粉芽孢桿菌，本試驗確定的最適溫度與秦楠等[23]試驗結果相似，說明此溫度接近頡頏菌最適生長溫度，細菌生長速度快，代謝旺盛。但最適pH與秦楠等[23]及劉小玉等[24]結果有所不同，這可能是菌株產生的活性物質種類和所抗真菌種類不同導致的。有研究指出細菌會通過增減堿基來適應環境溫度及pH的變化[25]，這可能會對其蛋白質組成及功能產生影響。此外，最佳培養時間、活菌數及其生長狀態明顯影響抑菌物質產量，死亡細菌也可能釋放出相應化學成分影響抑菌物質活性，這也是接菌量及培養液裝量影響抑菌率的主要原因[26]。本試驗在搖床轉速120 r/min時抑菌率最高，但也有高轉數下抑菌效果更好的報道[27]。這可能與頡頏菌對氧氣的需求量有關。王晶[26]試驗結果表明培養基種類對不同接菌量下活性物質產量的影響，揭示了各培養條件間的相互作用。所以對于確定菌株的最佳發酵條件，除了單因素試驗，常通過方差分析選出影響顯著的因素進行響應面設計[23],并應用模型綜合評估其對菌株生長的影響[28]，利于進一步優化菌株發酵工藝，提高產量，加快試驗進程[29]。

對菌株B10作用機制的研究證實，粗提蛋白能明顯抑制菌絲生長，破壞菌絲形態。馮蓉等[30]及Brown等[31]也發現了真菌菌絲在活性物質作用下的變化。但前者的結果顯示這一改變影響了真菌生長，后者則是降低了真菌毒力，所以菌株B10最根本的抑菌機制還需深入研究。純化的幾種活性蛋白中，幾丁質結合蛋白[32]和殼聚糖酶[33]是已被證實的能有效頡頏真菌的活性物質。他們作用于幾丁質和殼聚糖，通過破壞真菌細胞壁發揮抗真菌作用。尤其是殼聚糖酶，其高生物降解性、無毒和抗微生物特性使其被廣泛應用。除了作為天然生物膜抑制劑直接對抗病原菌[34]，其酶解殼聚糖產生的殼寡糖也具有抗菌及抗氧化活性[35]。其余各蛋白均存在其頡頏真菌的相關報道(如含FAD/FMN的脫氫酶[36]、枯草桿菌蛋白酶[37]、Cupin家族蛋白[38]及LCI家族蛋白[39])或其作用方式可能會對真菌產生一定影響(如孢子水解酶[40]及細胞壁水解酶[41])。而這些蛋白的具體作用效果還需通過后續試驗進行驗證。

4 結 論

本研究分離鑒定出1株抑制黃曲霉菌絲生長的解淀粉芽孢桿菌B10，其最優培養條件為溫度40 ℃，培養時間36 h，接種量3%，轉速120 r/min，pH 6.0，裝液量30 mL，其抑菌活性成分可能是幾丁質結合蛋白、殼聚糖酶等。