長鏈非編碼RNA在PEDV感染Vero-E6細胞中對自噬的調控作用

王梓行，鄧興梅，邱潤輝，朱德馨，李 佳，陶婷婷，朱嘉樂，孫志華,2,3，張 輝,2,3

(1.石河子大學動物科技學院，石河子 832000；2.新疆生產建設兵團動物疾病防控重點實驗室，石河子 832000；3.動物健康養殖國家國際聯合研究中心，石河子 832000)

豬流行性腹瀉(porcine epidemic diarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的一類急性傳染病，發病豬表現為腹瀉、消瘦、精神消沉等特征[1]。PEDV在感染豬后，S蛋白與細胞膜上的氨基肽酶N(APN)受體結合侵入豬的小腸上皮細胞引起細胞損傷[2]，腸絨毛膜萎縮、脫落。PEDV可以感染各年齡段的豬，其中仔豬的臨床癥狀最為嚴重，死亡率最高可達100%。迄今為止，基于原型毒株CV777制成的滅活苗和減毒苗對于減少PED的危害仍具有重要意義，但在近年來的免疫壓力下，PEDV的S基因頻繁突變，比原型毒株CV777毒力更強的PEDV毒株在中國豬群傳播，這使得許多采取常規免疫程序的豬場的仔豬大量死亡[3]。因此，新型疫苗的研發[4]、疫苗的升級以及尋找新的藥物靶點來發展相關藥物研究對減少PED對養豬業造成的損失有著重要的意義。

自噬是真核生物特有的通過溶酶體降解細胞內物質成分的統稱[5]。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3)，屬于自噬相關蛋白8(ATG8)的同源物。自噬發生時，proLC3經過ATG4的剪切形成LC3Ⅰ,LC3Ⅰ經過ATG7和ATG3修飾后，與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3Ⅱ，LC3Ⅱ可穩定存在于自噬小體膜上，LC3Ⅱ的檢測被認為是自噬檢測的金標準[6]。研究表明，病毒感染細胞可引起細胞自噬，而細胞自噬又會影響病毒的復制[7]。如豬繁殖與呼吸綜合征病毒誘導Marc-145細胞自噬進而提高病毒的復制效率[8]，新城疫病毒感染Vero細胞后誘導自噬并在感染期間促進新城疫病毒的復制[9]。Guo等[10]證實PEDV感染Vero細胞后誘導細胞自噬以促進PEDV的復制。據報道，人源長鏈非編碼RNA(lncRNA)-HOTAIR是一類與細胞自噬密切相關的lncRNA分子[11]，在多種癌癥和細胞中均有報道。然而，在動物疫病的相關的研究中，lncRNA-HOTAIR的調控作用鮮有報道。

本研究通過建立PEDV誘導非洲綠猴腎細胞(Vero-E6)自噬模型，篩選lncRNA-HOTAIR同源序列并結合Western blotting和實時熒光定量技術檢測其在PEDV感染Vero-E6細胞過程中的調控作用，進而通過RNA干擾技術驗證所得同源序列在PEDV誘導Vero-E6細胞發生自噬中的作用，為揭示lncRNA在PEDV感染Vero-E6細胞過程中發揮調控作用提供依據，對PEDV致病機制的研究、PED的防治以及新型藥物靶點的開發具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞與毒株 Vero-E6細胞和PEDV毒株均由新疆石河子大學動物疾病防控兵團重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM細胞培養液、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；UltraSYBR Mixture(Low ROX)熒光定量染料、Ultrapure RNA Kit均購自康為世紀生物科技有限公司；cDNA反轉錄試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；Advanced系列轉染試劑購自Zeta Life公司；LC3A/B Rabbit mAb購自Cell Signaling Technology(CST)公司；HRP AffiniPURE Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Earthox公司；高敏性ECL化學發光檢測試劑盒購自南京諾維贊生物科技股份有限公司；高通量實時熒光定量PCR儀(QuantStudioTM5 Real-time PCR Instrument A23134)購自Thermo Fisher Scientific公司；電泳儀(DYCZ-24EN)購自北京六一生物科技有限公司；化學發光成像儀(FluorChem E)購自ProteinSimple公司。

1.2 方法

1.2.1 猴源同源序列預測 用LongMan在線軟件(http:∥lncRNA.sum.edu.cn)對lncRNA-HOTAIR進行猴源同源序列(lncRNA-M)篩選分析；將篩選得到的序列上傳至在線軟件RNAfold(http:∥rna.tbi.nuivie.ac.at/cgi-bin /RNAWebSuit/RNAfold.cgi)生成序列的二級結構圖；利用LncLocator在線預測軟件(http:∥www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/lncLocator/#)對lncRNA-M序列進行分析，預測其核質分布。

1.2.2 引物及干擾片段的設計及合成 根據GenBank中PEDV N、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、lncRNA及GAPDH mRNA序列，用Primer Premier 5.0設計特異性引物，具體信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。lncRNA的3條干擾片段(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)均由安徽通用生物系統有限公司設計并合成。

1.2.3 細胞培養 將保存在的第8代Vero-E6細胞從液氮中取出后迅速放入37 ℃溫水中，待完全融化后轉移至15 mL離心管中以1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含10% FBS的DMEM重懸細胞，轉移到細胞培養瓶中，置于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。待細胞匯合度達到90%～100%時進行傳代培養，傳代2次后的細胞用于后續試驗。

1.2.4 PEDV感染的Vero-E6細胞模型的建立及鑒定 取復蘇后傳代3次處于對數生長期的Vero-E6細胞，棄去培養液后用PBS洗3次，加入500 μL PEDV與1 mL DMEM，添加終濃度為10 μg/mL的胰酶，置于37 ℃、5% CO2的培養箱孵育2 h，每隔20 min搖晃培養瓶。孵育結束棄病毒液，添加6 mL維持液(6 mL DMEM添加24 μL胰酶)繼續置于37 ℃、5% CO2的培養箱培養。定時觀察細胞狀態以及細胞病變的產生。感染48 h后，棄去病毒液，用PBS清洗細胞2次，用Trizol法提取總RNA，并反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板，進行N基因的擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30個循環；72 ℃延伸10 min。用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物。

表1 引物及干擾片段信息

1.2.5 Western blotting檢測LC3蛋白表達水平 按1.2.4的方法建立PEDV感染Vero-E6細胞模型，分別在0、6、12、24、36和48 h收集細胞，加入450 μL蛋白裂解液后置于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min，收集上清后用BCA法測蛋白濃度，將蛋白定量后煮沸變性備用。制備12%分離膠和5%濃縮膠，上樣量為20 μL，轉膜35 min，5%脫脂奶粉封閉3 h，LC3A/B Rabbit mAb一抗(1∶1 000) 4 ℃過夜孵育，HRP AffiniPURE Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)二抗(1∶10 000)4 ℃孵育3 h，ECL顯色，化學發光成像儀拍照并保存，用于后續分析。

1.2.6 實時熒光定量PCR檢測LC3和lncRNA-M的表達水平 按1.2.4的方法建立PEDV感染Vero-E6細胞模型，分別在0、6、12、24、36和48 h后收集細胞并提取總RNA，反轉錄合成cDNA。以GAPDH為內參基因，實時熒光定量PCR檢測LC3Ⅰ、LC3Ⅱ及lncRNA-M的mRNA表達水平(每組各3個重復)。PCR反應體系10 μL：SYBR 5 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環。采用2-△△Ct法計算各基因的相對表達量。

1.2.7 lncRNA-M干擾對自噬的影響 將Vero-E6細胞接種于12孔板中，當細胞匯合度達到50%時，將3條lncRNA-M干擾片段(表1)按照siRNA產品使用說明書進行轉染，每條干擾片段做3個重復孔并設立對照組(siRNA NC)。 轉染后24 h按照1.2.4方法接毒。接毒24 h后按照1.2.6方法檢測lncRNA-M的mRNA表達水平，篩選出干擾效率最高的1條siRNA。將Vero-E6細胞均勻接種于6孔板并設立lncRNA-M干擾組及其對照組，待細胞匯合度達到50%時分別轉染干擾效率最高的干擾片段和siRNA NC，細胞長滿后均進行接毒。按照1.2.5方法分別收集接毒24、48 h的細胞，檢測LC3蛋白的表達水平。

1.3 數據統計與分析

每個試驗均重復3次。采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析，組間差異采用t檢驗,結果用平均值±標準差表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 lncRNA-M篩選及其二級結構與核質分布預測

LongMan在線軟件預測得到自噬相關分子lncRNA-HOTAIR的lncRNA-M為lncRNA 0.1(Ensembl Gene ID：ENSG00000228630.1_Macaque)，lncRNA 0.1位于第11號染色體上,全長2 626 bp；利用RNAfold在線軟件結合lncRNA 0.1的序列信息使用熱力學最小自由能法預測并生成lncRNA 0.1的二級結構(圖1A)，其由大量莖區、發卡環、內環以及少量的凸環和多分枝環構成；lncRNA 0.1核質分布分析結果顯示，lncRNA 0.1在細胞質中的分布為41.88%，在細胞核中的分布為37.78%(圖1B)。

圖1 lncRNA 0.1二級結構(A)及核質分布(B)預測結果Fig.1 Prediction results of lcnRNA 0.1 secondary structure (A) and subcellular localization (B)

2.2 PEDV感染Vero-E6細胞病變觀察及PEDV N基因鑒定

PEDV感染Vero-E6細胞48 h后可觀察到明顯的細胞病變，與對照組(圖2A)相比，感染組的細胞呈現明顯皺縮、細胞膜融合、細胞聚集成團形成合胞體及大量脫落的現象(圖2B)。1.0%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，在1 326 bp處出現目的條帶(圖2C)，與預期大小一致。說明PEDV感染Vero-E6細胞模型成功建立，可用于后續試驗。

①A，對照組(100×)；B，PEDV感染組(100×)；C，目的片段擴增電泳圖。②M，DL2000 DNA Marker；1～3，Vero-E6細胞；4，陰性對照①A,Control group (100×);B,PEDV infected group (100×);C,Amplification electrophoretogram of the target fragment.②M,DL2000 DNA Marker;1-3,Vero-E6 cells;4,Negative control圖2 PEDV感染Vero-E6及PEDV N基因的PCR結果Fig.2 PEDV infected Vero-E6 and PCR results of PEDV N gene

2.3 PEDV感染Vero-E6細胞自噬檢測

PEDV感染Vero-E6細胞6、12、24、36、48 h后，Western blotting檢測結果顯示，LC3Ⅱ蛋白的表達量隨著感染時間的延長而增加(圖3A)；根據LC3Ⅰ、LC3Ⅱ蛋白條帶計算灰度值并繪制柱狀圖，結果顯示LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白的比值在48 h最高，且極顯著高于0 h (P<0.01，圖3B)；實時熒光定量PCR檢測LC3的表達結果顯示，LC3Ⅱ、LC3ⅠmRNA比值在PEDV感染Vero-E6細胞6、12、24、36和48 h后總體呈現上升趨勢，在48 h表達量最高，極顯著高于0 h (P<0.01)(圖3C)。

①A，LC3Ⅱ、LC3Ⅰ蛋白Western blotting檢測；B，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ蛋白比值；C，LC3Ⅱ和LC3Ⅰ mRNA比值。②與0 h相比，**，差異極顯著(P<0.01)。圖4同①A, Western blotting detection of LC3Ⅱ and LC3Ⅰ proteins; B, Ratio of LC3Ⅱ and LC3Ⅰportein; C, Ratio of LC3Ⅱ and LC3Ⅰ mRNA. ②Compared with 0 h, **, Extremely significant difference (P<0.01). The same as fig.4圖3 PEDV感染Vero-E6后LC3蛋白和mRNA的相對表達量Fig.3 Expression of LC3 protein and mRNA after PEDV infection

2.4 PEDV感染的Vero-E6細胞lncRNA 0.1表達情況

PEDV感染Vero-E6細胞6、12、24、36、48 h后，實時熒光定量PCR檢測結果顯示，lncRNA 0.1 的相對表達量呈現上升趨勢，12、24、36、48 h時lncRNA 0.1的表達量均極顯著高于0 h (P<0.01)(圖4)。

圖4 PEDV感染Vero-E6后lncRNA 0.1的表達Fig.4 Expression of lncRNA 0.1 after PEDV infection

2.5 干擾后lncRNA 0.1 mRNA和LC3蛋白的表達水平

轉染3條干擾片段后，實時熒光定量PCR檢測結果顯示，siRNA-2的干擾效率最高，干擾效率為80%(圖5A)。Vero-E6細胞轉染siRNA-2后，待細胞匯合度達到90%接毒，Western blotting檢測結果顯示，與對照組相比，干擾組接毒24和48 h后自噬標志蛋白LC3的表達均明顯降低，說明自噬受到抑制(圖5B)。

①與對照組相比，**，差異極顯著(P<0.01)。②1、3，對照組24、48 h LC3蛋白表達水平；2、4，siRNA-2干擾組24、48 h LC3蛋白表達水平①Compared with control group, **, Extremely significant difference (P<0.01). ②1 and 3, LC3 protein expression levels of control group at 24 and 48 h; 2 and 4, LC3 protein expression levels of siRNA-2 interference group at 24 and 48 h 圖5 lncRNA 0.1 mRNA(A)與LC3蛋白(B)的表達水平Fig.5 Expression of lncRNA 0.1 mRNA (A) and LC3 protein (B) after interference

3 討 論

自2010年至今，豬流行性腹瀉在中國各地均有爆發，對中國的養豬業產生了巨大的危害，造成了嚴重的經濟損失，相關流行病學調查結果表明，在中國33個省市地區的豬腹瀉疫情中，PEDV為主要疫病病原[12]。由于近年引起中國仔豬腹瀉的主要病原是PEDV變異株[13]，使用經典株CV777的疫苗并不能有效地阻止PEDV變異株的感染[14]。因此，為解決中國各地PED的普遍暴發以及各地毒株類型的錯綜復雜而導致的疫苗保護性差、PEDV防治藥物單一這一問題，迫切需要對PEDV的致病機理進行更深入地研究以開發新的藥物靶點。目前，PEDV的研究主要集中在蛋白水平即探究病毒與宿主蛋白的互作[15]，但在核酸水平對于病毒與宿主的互作研究較少。因此，本試驗從核酸水平出發，探究lncRNA對PEDV感染細胞自噬的調控作用。

與其他幾種RNA病毒一樣，冠狀病毒長期以來被認為與細胞自噬途徑相互作用[16]。自噬是一種保守的細胞過程，涉及自噬體的形成，自噬體包圍細胞質成分，如長壽命蛋白質、蛋白質聚集體和細胞器等，并將這些成分運送到溶酶體進行降解。盡管自噬是一種組成性途徑，但當細胞處于應激條件下，如饑餓或病原體感染時，自噬會上調。本研究中，在PEDV感染Vero-E6細胞后不同時間點，實時熒光定量PCR結果顯示LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值呈上升趨勢；Western blotting結果顯示自噬標志蛋白LC3的表達量隨著感染時間的增加而增多，試驗結果從mRNA和蛋白的水平證實了PEDV感染細胞后誘導細胞發生自噬。

研究表明，lncRNA不僅能調節mRNA的轉錄和翻譯，還參與調節病毒感染宿主后的抗病毒感染過程[17]。目前已有文章報道lncRNA對病毒的復制有重要影響[18],如馬齊蔓等[19]發現lncRNA 1620在牛病毒性腹瀉病毒感染牛腎細胞(MDBK)后參與調控細胞凋亡和病毒復制；王磊等[20]發現lncRNA 2694.1在豬流行性腹瀉病毒感染Vero細胞后參與調控PEDV的復制，當過表達lncRNA 2694.1時，細胞中的病毒拷貝數明顯升高等。lncRNA-HOTAIR是一類與自噬密切相關的lncRNA分子。據報道，在腸胃道間質瘤細胞中lncRNA-HOTAIR通過miR-130a/ATG2B通路激活自噬[21]；在肺泡巨噬細胞中lncRNA-HOTAIR通過miR-17-5p/ATG2/ATG7/ATG16通路調控自噬[22]。然而病毒感染后lncRNA-HOTAIR的調控作用以及lncRNA-HOTAIR在動物模型中的研究鮮有報道。本試驗通過生物信息學分析，篩選到了lncRNA-HOTAIR同源序列lncRNA 0.1,生物信息學分析結果得出lncRNA 0.1位于11號染色體，主要分布在細胞質和細胞核中，且在細胞質中的分布高于細胞核，分別為41.88%和37.78%。通過實時熒光定量PCR證實了在PEDV感染Vero-E6細胞后lncRNA 0.1的表達量隨著感染時長的增加而升高。 成功干擾lncRNA 0.1后，自噬標志蛋白LC3的表達明顯降低，自噬受到抑制，證實了lncRNA 0.1對自噬具有促進作用。這一結果不但從核酸的水平驗證了PEDV與宿主相互作用，也為自噬與lncRNA分子之間建立了聯系。隨著高通量測序技術日益成熟，對于PEDV感染細胞的全轉錄組測序工作已經陸續完成[23]，隨著越來越多表達差異顯著的lncRNA分子被挖掘，這些差異表達的lncRNA分子通過何種途徑和哪些通路發揮調控作用也是亟需解決的問題。

綜上所述，lncRNA 0.1 在PEDV誘導的Vero-E6細胞自噬中具有促進作用，這可能是病毒為促進其本身生存繁殖的一種生存策略，推測lncRNA 0.1可能與某個或多個miRNA互作而形成這種調節作用。總之，本研究為進一步研究PEDV感染過程中lncRNA調控自噬及宿主-病毒相互作用提供了一定的試驗基礎和理論依據；同時lncRNA分子有可能成為PEDV診斷和預后的生物標志物。

4 結 論

本研究結果表明，在PEDV感染Vero-E6細胞過程中自噬被激活，篩選出lncRNA 0.1可以調控自噬，且干擾lncRNA 0.1后，LC3蛋白的表達明顯降低，細胞自噬受到抑制，說明lncRNA 0.1對于細胞自噬的發生起到正調節作用。結果可為進一步揭示lncRNA在PEDV感染期間調節自噬的功能提供基礎，同時為PEDV的防治和相關藥物靶點的開發提供新思路。