山羊乳腺上皮細胞氧化損傷模型的建立

張元鋅，王閆宇，云艷虹，陳俊樸，石惠宇，王學梅

(海南大學動物科技學院，海口 570228)

母山羊產前15 d到產后15 d這段特殊時期為圍產期，在圍產期由于機體經歷了劇烈的生理變化，能量需求較大，但在圍產前期瘤胃易受到胎兒壓迫，使得采食獲得的營養成分減少，因此機體多處于能量負平衡狀態[1]。在負平衡狀態下，體內會出現營養物質代謝不足、皮質甾類激素大量釋放的現象[2]，此時機體需大量利用體脂進行供能[3]，產生的非酯化脂肪酸會進入乳腺組織，調節產生大量活性氧(reactive oxygen species，ROS)，造成乳腺出現氧化損傷甚至免疫抑制[4]，從而引發乳腺炎[5]。同時乳腺細胞作為乳脂和乳蛋白合成分泌的重要場所，對維持其內部的氧化-抗氧化穩態具有重要的意義。因此，平穩的度過圍產期減少氧化應激的發生，有利于減少乳腺受到的損傷，提高母羊哺乳能力以及下個泌乳周期的生產性能和繁殖性能[6]。過氧化氫(H2O2)憑借其強氧化性且極易透過細胞膜誘發一系列反應攻擊細胞[7]，被廣泛應用于誘導氧化損傷[8]。以H2O2為誘導劑建立細胞體外氧化損傷模型的研究已有很多，但是鮮見關于建立山羊乳腺上皮細胞(GMEC)氧化損傷模型的研究。因此，通過GMEC建立體外的山羊氧化應激模型，有利于了解其氧化應激的發生機制并尋找應對的措施。

目前，國內外學者普遍選擇在飼料中添加某些抗氧化劑來維持山羊機體氧化穩態，如丁酸鈉、亞硒酸鈉、煙酰胺、花青素等。Chang等[9]研究發現，高精料飼糧中補充丁酸鈉能夠緩解高精料飼糧造成的奶山羊乳腺氧化應激，減少乳腺細胞的凋亡。孫婧陶等[10]研究發現，0.5 μg/mL亞硒酸鈉可以有效減少H2O2對延邊奶山羊乳腺上皮細胞的損傷。尹清艷[11]和何家俊[12]對圍產期奶山羊的研究均發現，飼料中添加煙酰胺有效降低了機體乳腺氧化產物的累積，提高了乳品質以及乳汁的抗氧化能力，改善了羔羊的免疫功能，從而提高羔羊存活率，其中花青素作為一種水溶性天然色素，因其安全性高、清除自由基能力強的特點[13]，近年來被學者廣泛研究。Xie等[14]研究表明，茄屬植物花青素可通過抑制胱天蛋白酶3(Caspase-3)的表達，減弱阿散酸對雞成纖維細胞的氧化應激。海南地區特有的含豐富花青素的紫大薯對緩解三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的小鼠結腸炎效果良好[15]。然而紫大薯花青素能否保護圍產期山羊的乳腺組織，以及減少氧化應激對乳腺細胞造成的損傷及其發揮作用的機制尚不清楚，亟需建立乳腺細胞氧化損傷的細胞模型進行深入的研究。因此，本試驗以H2O2作為氧化損傷模型誘導劑，以GMEC為試驗對象，依據細胞存活率、培養液及細胞中ROS含量、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)活性及抗氧化標志物的活性、含量的變化，探索最佳的H2O2處理濃度與時間，建立可靠的細胞氧化損傷模型，為今后在細胞層面探究紫大薯花青素對氧化損傷的保護機制提供模型條件，也為將來在飼料中添加海南紫大薯保護圍產期山羊乳腺組織提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 GMEC購自北京北納創聯生物技術研究院。

1.1.2 主要試劑 胎牛血清(FBS)購自HyClone公司；0.25%胰蛋白酶、DMEM/F12培養基、青霉素-鏈霉素混合溶液(100×雙抗)均購自Gibco公司；CCK-8購自Biosharp公司；表皮生長因子(EGF)購自Sigma公司；H2O2購自國藥集團化學試劑有限公司；過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、總抗氧化能力(T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物科技有限公司；動物細胞裂解液購自TIANDZ公司；蛋白酶抑制劑(PMSF)、PBS、ROS、LDH試劑盒均購自上海碧云天生物技術有限公司。

完全培養基：DMEM/F12+6% FBS+1%雙抗+0.1% EGF。

終止培養基：DMEM/F12+10% FBS。

H2O2工作液：取10 μL H2O2原始液(10 mol/L)加入990 μL超純水配制成100 mmol/L H2O2母液，分別取35、43、46、49、52、55 μL H2O2母液用超純水配制成100 μL的H2O2儲備液；取各H2O2儲備液100 μL添加9 900 μL DMEM/F12培養基稀釋至350、430、460、490、520、550 μmol/L備用。

1.2 方法

1.2.1 H2O2處理濃度和時間的篩選 取培養24 h后處于對數生長期的GMEC，按每孔3.8×103個細胞接種于96孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養箱中培養24 h。取出后設28個處理組，每個處理組設6個重復。采用7×4二因子完全隨機試驗設計，即第一因素為H2O2濃度：0(對照組)、350、430、460、490、520和550 μmol/L，第二因素為H2O2處理時間：8、11、14、17 h。每孔添加工作液100 μL后置于37 ℃、5% CO2培養箱內進行培養，培養至各時間點吸出培養液，用PBS清洗3遍。之后向每孔中加入10 μL CCK-8試劑及100 μL不含FBS的DMEM/F12培養基，放回培養箱孵育2 h顯色。用酶標儀測定D450 nm值，并按照以下公式進行計算，根據存活率篩選H2O2處理濃度和時間。

GMEC相對存活率(%)=測定組D450 nm/對照組D450 nm×100%

1.2.2 H2O2處理對LDH活性的影響 篩選出細胞存活率在70%左右時H2O2處理濃度與時間后，取培養24 h后處于對數生長期的細胞按每孔1.3×105個細胞接種于6孔板中，置于培養箱中培養24 h。 取出后設24個處理組，每個處理組設3個重復。 設H2O2濃度為0、350、430、460、490、520 μmol/L，設作用時間為4、6、8、10 h。每孔添加工作液3 mL后置于37 ℃、5% CO2培養箱內進行培養，培養至各時間點后吸出上清液，按照試劑盒說明書測定上清液中LDH活性。

1.2.3 H2O2處理對ROS含量的影響 1.2.2中取上清后的細胞經PBS清洗3次后，按照說明書測定細胞內ROS含量，通過熒光酶標儀在488 nm激發波長，525 nm發射波長下進行測定，結果以相對熒光強度表示。

1.2.4 H2O2處理對細胞抗氧化標志物的影響 1.2.2中取上清后的細胞用PBS清洗3次后，每孔加入500 μL細胞裂解液與5 μL蛋白酶抑制劑，冰浴狀態下裂解30 min后用細胞刮刀刮凈孔底，將裂解液收集至1.5 mL離心管中做好標記，1 000 r/min離心5 min，取上清備用。 按照試劑盒說明書分別檢測細胞中MDA含量、GSH-Px活性及上清液中SOD、CAT活性和T-AOC。

通過抗氧化標志物的水平進一步確定H2O2最適處理濃度與處理時間。

1.3 數據統計分析

用SPSS 24.0統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，采用Duncan氏法進行組間多重比較，主體間效應方式采用單變量線性分析。結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著。

2 結 果

2.1 H2O2處理對細胞存活率的影響

由表1可知，當處理時間為8、11、14、17 h時，GEMC存活率隨H2O2濃度的升高呈下降趨勢。 H2O2處理8 h時,350、430、460 μmol/L 3個濃度下的細胞存活率分別為64.6%、72.9%、66.2%，較對照組顯著降低(P<0.05)，H2O2濃度>460 μmol/L 的處理組細胞存活率已降至60%以下。當處理時間超過8 h后,各濃度處理下的細胞存活率均低于60%，與本試驗70%的預期存活率有明顯差距。因此，后續試驗所用H2O2濃度設為350、430、460、490、520 μmol/L,處理時間設為4、6、8、10 h。

2.2 H2O2處理對LDH活性的影響

由表2可知，培養液中LDH活性隨H2O2處理時間的延長呈持續增加的趨勢，在4 h時除430 μmol/L處理組外，各濃度處理下LDH活性均顯著高于對照組(P<0.05)；與對照組相比,6～10 h各處理組LDH活性均顯著升高(P<0.05)，且H2O2濃度越大處理時間越長，變化就越明顯，其中430 μmol/L處理組在8 h時的LDH活性較4 h有顯著提高(P<0.05)，>430 μmol/L濃度的處理組在6 h時LDH活性即顯著高于4 h時的LDH活性(P<0.05)。

表1 各組GMEC存活率

表2 各組LDH活性

2.3 H2O2處理對ROS含量的影響

由表3可知，細胞內ROS含量隨H2O2處理時間的增加趨勢，4 h時各處理濃度ROS含量無明顯變化；6 h時，各處理濃度下GMEC內ROS的含量較對照組顯著升高(P<0.05)；8 h時各處理濃度下GMEC內ROS的含量較對照組均有顯著升高(P<0.05)，同時各濃度處理組ROS含量較6 h均顯著升高(P<0.05)，說明8 h為ROS含量變化的轉折時間點,此時430 μmol/L處理組ROS相對含量達到168.3%，且在8 h時各處理組ROS含量趨于穩定。

表3 各組ROS含量

2.4 H2O2處理對抗氧化標志物活性的影響

由表4和5可知，CAT活性和T-AOC隨H2O2處理時間的延長呈先升后降再上升的整體趨勢。在6 h時，與4 h相比除430μmol/L處理組CAT活性顯著降低外(P<0.05)，各處理組CAT活性和T-AOC均出現了升高的現象，且490、520 μmol/L處理組T-AOC較對照組有顯著的升高(P<0.05)。8 h時各處理組CAT活性和T-AOC較6 h明顯下降，且430、520 μmol/L處理組的CAT活性和T-AOC較6 h均顯著降低(P<0.05)，說明處理8 h為CAT活性和T-AOC變化的轉折時間點，此時350、430 μmol/L處理組CAT活性和T-AOC較對照組均顯著降低(P<0.05)。然而在10 h時除460、490、520 μmol/L處理組CAT活性比8 h降低外，其余各處理組CAT活性和T-AOC較8 h明顯上升。

由表6和7可知，SOD和GSH-Px活性隨H2O2處理時間的延長呈下降的趨勢。4 h時460 μmol/L處理組SOD和GSH-Px活性較對照組均顯著降低(P<0.05)；6 h時除350、460 μmol/L處理組SOD活性變化不明顯外，各處理組SOD和GSH-Px活性較對照組均顯著降低(P<0.05)。在8 h時除350 μmol/L處理SOD活性變化不明顯外，各處理組SOD和GSH-Px活性較對照組均顯著降低(P<0.05)，此時430 μmol/L處理組SOD活性較4 h顯著降低(P<0.05)，GSH-Px活性較6 h顯著降低(P<0.05)。 10 h時各處理組SOD和GSH-Px活性較對照組均顯著降低(P<0.05)。

表4 各組CAT活性

表5 各組T-AOC活性

表6 各組SOD活性

表7 各組GSH-Px含量

由表8可知，MDA含量隨H2O2處理時間的延長呈先降后升的整體趨勢。6 h時除350 μmol/L處理組外，MDA含量較4 h時均出現明顯降低。 8 h時430 μmol/L處理組較6 h明顯上升，且430、490、520 μmol/L處理組MDA含量較對照組顯著提高(P<0.05)。10 h時各處理組MDA含量均較對照組顯著提高(P<0.05)，此時350 μmol/L處理組較8 h顯著提高(P<0.05)，430 μmol/L處理組較6 h顯著提高(P<0.05)。

由表9可知，T-AOC主要受處理時間影響(P<0.05)；MDA含量主要受處理濃度影響(P<0.05)；CAT活性既受處理時間又受處理濃度影響(P<0.05)；細胞存活率、SOD、GSH-Px、LDH活性和ROS含量既受處理時間又受處理濃度影響(P<0.05)，同時還受到兩種因素的交互影響(P<0.05)。

表8 各組MDA含量

表9 處理時間和濃度的主體效應和相互效應對各指標的影響

續表

3 討 論

在構建氧化應激模型時，細胞存活率通常在70%左右，降低至50%時會出現不可逆的嚴重損傷[16]；高于70%則說明細胞狀態良好，氧化后沒有產生較為明顯的損傷；低于60%則說明細胞開始大量死亡并逐漸出現不可逆的氧化損傷，不利于試驗的進一步進行[17-18]。本試驗在構建損傷模型時，由于初始處理時間8 h的設定跨度過大，導致所有處理濃度下GMEC的存活率均低于70%，并且隨著處理時間的延長損傷程度逐漸加重，不符合建立模型的要求。因此，在處理時間和濃度上做出了一些調整，重新設定損傷時間為4、6、8、10 h，并去除較大的550 μmol/L處理濃度，防止出現不可逆的嚴重損傷以便后續試驗的進行。

由于培養液中添加不同濃度的H2O2導致外源ROS大量進入細胞，ROS作為氧自由基在體內發揮著重要的作用，既可以作為第二信使誘導并維持癌細胞的致癌表型，還可以誘導細胞衰老和凋亡[19]。正常代謝產生的ROS會被細胞內抗氧化蛋白所消耗[20]，然而在氧化應激狀態下，大量產生的ROS對細胞DNA、蛋白質等大分子物質造成損傷，從而影響細胞正常生理功能甚至引發凋亡[21]。在這種情況下，ROS可以直接或間接作為凋亡信號通過BH3(Bcl-2 homology domain 3-only)蛋白引起Bax(Bcl-2-asslciated protein X)蛋白移位至線粒體外膜并改變其通透性，使線粒體內的促凋亡因子釋放到細胞質內引發凋亡[22]。LDH作為一種存在于細胞質中的酶，正常情況下不會分泌到胞外，只有在細胞膜受損或細胞凋亡的情況下才會釋放到細胞外[23]，因此培養液中LDH活性常被用來反映細胞凋亡情況[24]。本研究結果顯示，GMEC內ROS含量在4 h時各處理組無明顯變化，在6～8 h時變化幅度較4～6 h時更大，說明4～6 h時產生的ROS較少，可能是被某些抗氧化酶消耗掉一部分；而培養液中LDH含量從4 h開始顯著升高，證明ROS含量一旦高于正常水平就可引發細胞凋亡。

抗氧化酶系統作為保護機體免受氧化損傷的屏障之一，主要由CAT、SOD和GSH-Px等多種抗氧化酶組成[25]。T-AOC可以反映機體內抗氧化物質對自由基的清除能力，以及各種抗氧化酶之間的協同程度，是評價機體抗氧化能力的重要指標[26]。MDA作為自由基在機體內發生脂質過氧化的終產物，不僅會影響抗氧化酶的活性，還會造成線粒體膜損傷[27]，因此也可作為判斷細胞損傷程度的條件之一。當氧化應激發生時，機體的抗氧化酶系統已存在較大的損傷或不足，因此人們常用黃酮類(如花青素)等一系列抗氧化活性物質來提高機體的抗氧化能力[28]。海南紫大薯塊莖含有大量且種類豐富的花青素及膳食纖維等活性成分[29]，使其在開發成為特色畜禽飼料方面具有巨大的潛力，Han等[30]研究發現紫大薯花青素可以顯著提高小鼠肝臟中SOD和GSH-Px的mRNA表達量。因此本試驗通過對過氧化產物及抗氧化能力2個方面進行評定，能夠較完整地反映細胞的損傷程度，也為后續探究海南紫大薯花青素對氧化損傷的保護能力提供模型基礎。

本研究結果顯示，在不同濃度H2O2處理下，GMEC的CAT活性和T-AOC在4～6 h出現了升高的現象，與此同時MDA含量短暫降低，且ROS含量增長緩慢。這可能是由于在H2O2的刺激下，細胞內部有關抗氧化的基因或蛋白被激活，通過調控核轉錄因子2-抗氧化反應元件(Nrf2-ARE)抗氧化機制[31]，增強CAT活性和T-AOC來應對受到的刺激使細胞內ROS含量保持相對穩定從而降低MDA含量，這與喬娜等[32]對小鼠精原細胞氧化損傷的研究中CAT、T-AOC和MDA的變化趨勢是一致的。由于刺激時間逐漸加長，刺激程度保持穩定，導致細胞無法長期有效地應對氧化應激從而造成不可逆的損傷。因此CAT活性和T-AOC在6～8 h明顯降低，與本研究中主效應分析結果顯著受處理時間影響的結果相一致。與此同時，細胞外LDH活性仍顯著升高，證明這些有限的保護機制無法阻止細胞凋亡。隨著H2O2處理濃度的增加，ROS的產量也逐漸增加，SOD和GSH-Px作為清除ROS的重要抗氧化酶在活性降低時可造成ROS大量堆積，從而引起脂質過氧化，使MDA的含量增加。本試驗結果表明，各H2O2濃度在不同時間的變化不明顯，而相同時間下H2O2濃度越高MDA含量增加越顯著，這與王吉等[33]在對豬腎細胞氧化損傷的研究中得出的MDA含量變化與單寧酸添加濃度呈正相關的結果一致，但其中具體的調控機制以及大分子物質的變化情況還需要進一步研究。

4 結 論

用430 μmol/L H2O2處理GMEC 8 h，細胞存活率降至72.9%，細胞內ROS和MDA含量均顯著升高，GSH-Px活性顯著降低，培養液中LDH活性顯著升高，CAT和SOD活性顯著降低，T-AOC活性明顯降低。表明本研究利用H2O2成功建立GMEC氧化損傷模型，適宜濃度為430 μmol/L，作用時間為8 h。