牛瘤胃微生物的分離鑒定與生化特性分析

李暢洋，高炳南，任雨龍，張 昊，孫 瑜，魏 笑，王秋菊

(黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319)

近年來奶牛營養代謝性疾病嚴重影響牛奶產量，而通過抗生素等藥物治療的方式，雖在一定程度上取得了效果，但也產生了極大的副作用。益生菌制劑通過利用動物體內存在的無害功能菌來調節動物的內外環境，可以達到基本解決營養代謝紊亂疾病的效果[1-2]。奶牛瘤胃內存在大量的微生物，在營養物質的消化吸收，即生長生產活動中發揮著不可替代的作用。本試驗通過分離奶牛瘤胃液中的菌株，采用16S rDNA序列相似性比對以及系統進化樹分析等方法對其進行種屬鑒定，再通過鑒定其生理生化特性，進一步確定各項功能與性質，以期利用其調節瘤胃微生物菌群比例和內環境穩定，對奶牛因營養紊亂等問題造成的疾病進行初步治療，為后續通過瘤胃內功能菌制備菌制劑提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 在黑龍江某養殖場選取10頭健康的成年荷斯坦奶牛，在飼喂前通過瘤胃管負壓采集瘤胃液，裝入充滿CO2的離心管中，放入37 ℃恒溫箱內帶回實驗室。

1.1.2 主要試劑 厭氧菌瓊脂培養基(HB0310)、MH瓊脂(HB6235)和PremixTaq均購自北京索萊寶科技有限公司；DL2000 DNA Marker、瓊脂糖均購自TaKaRa公司。

1.1.3 主要儀器 厭氧培養箱(YQX-I)購自上海躍進試驗儀器有限公司；恒溫培養箱(DHP-9272)購自上海一恒科學儀器有限公司；PCR基因擴增儀(GE9612T-S)購自杭州柏恒科技有限公司；電泳儀(DYY-6C)購自北京市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離與純化 將采集回的瘤胃液在無菌操作臺中用紗布過濾，經過濾后的瘤胃液用生理鹽水進行101、102、103、104、105、106、107、108、109倍的稀釋，涂布接種于高壓滅菌后的NA培養基中。 在厭氧超凈工作臺內按照生長情況培養12～24 h后，挑取疑似單個菌落進行純化培養，重復此步驟3～4次，直到培養基內出現單一菌落。

1.2.2 細菌的PCR鑒定 使用煮沸法提取細菌DNA。采用16S rDNA通用引物進行細菌的PCR鑒定。引物序列為：27F：5′-AGAGTTTGATCCT-GGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTAC-GACTT-3′[3]，預期擴增產物大小為1 600 bp左右。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應體系25 μL：模板DNA 1 μL，PremixTaq12.5 μL,上、下游引物各1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環；72 ℃終延伸5 min，4 ℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，陽性樣品送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序，測序結果與NCBI數據庫中相應序列進行比對，采用Mega-X構建系統發育樹。

1.2.3 細菌的生化特性鑒定 對分離菌進行產蛋白酶、產淀粉酶、吲哚實驗、甲基紅實驗以及產硫化氫實驗。

1.2.4 生長特性鑒定 將得到的菌株分別接種于LB培養基中，以接種菌液LB液體培養基培養0 h為空白對照，置于搖床內37 ℃、150 r/min培養48 h。分別在0、2、4、6、8、10、12、16、18、24、36和48 h取培養液測定D600 nm值，以時間為橫坐標，以培養液的D600 nm值為縱坐標繪制生長曲線。

1.2.5 耐酸和耐堿試驗 將分離菌用LB液體培養基培養24 h后，取100 μL的菌液加5 mL的生理鹽水，將其pH分別調至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和7.0、7.5、8.0、8.5，分別測定分離菌的耐酸和耐堿特性。每組3個重復，以pH為橫坐標，以培養液的D600 nm值為縱坐標繪制菌株生長曲線。

1.2.6 耐膽鹽試驗 在5 mL的生理鹽水內分別加入0、0.025、0.050、0.075、0.100 g的膽鹽，使其膽鹽濃度分別達到0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%共5個梯度，再加入100 μL經LB液體培養基培養24 h后的菌液。每組3個重復，放置搖床培養24 h后測其D600 nm值，測定其對酸堿膽鹽的耐受程度。以膽鹽濃度作為橫坐標，培養液D600 nm值為縱坐標分別繪制菌株生長曲線。

2 結 果

2.1 細菌的分離及鑒定

采集回來的奶牛瘤胃液經涂布、提純、擴培后，分別得到20個顏色單一、形態相同、生長狀況良好的單一菌落。20株分離菌的16S rDNA序列擴增產物大小均為1 600 bp左右(圖1)，與預期結果一致。序列測定和比對結果顯示，20株分離菌屬于7種不同的菌。在7株不同菌中各選擇1株(分別為L7、C2、K7、S7、M7、F7和T7)進行后續試驗。

2.2 相似性與系統發育樹分析

相似性分析結果表明，S7與嗜麥芽窄食單胞菌(登錄號：KU726007.1)的相似性達到100%，T7與吉氏庫特菌屬Kurthiapopuli(登錄號：NR_144587.1)的相似性達到98.8%，M7與馬鏈球菌(登錄號：DQ294304.1)的相似性達到98.6%，L7與解淀粉芽孢桿菌(登錄號： KC441795.1)的相似性達到100%，K7與枯草芽孢桿菌(登錄號：JQ229801.1)的相似性達到49.5%，F7與弗氏酸檸檬桿菌(登錄號：AB734052.1)的相似性達到100%，C2與地衣芽孢桿菌(登錄號：AB008509.1)的相似性達到81.2%(圖2)。系統發育樹結果(圖3)與相似性分析結果一致，初步判定S7、T7、M7、L7、K7、F7和C2分別為嗜麥芽窄食單胞菌、吉氏庫特菌、馬鏈球菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、弗氏酸檸檬桿菌和地衣芽孢桿菌。

M，DL2000 DNA Marker；1～9，分離株M，DL2000 DNA Marker；1-9,Isolates圖1 部分分離菌16S rDNA PCR擴增結果Fig.1 16S rDNA PCR amplification results of partial isolates

圖2 16S rDNA相似性比對結果Fig.2 Similarity comparison results of 16S rDNA

圖3 系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree

2.3 生化特性結果

由表1可知，7株分離菌中僅有C2和T7在吲哚實驗反應中為陽性，證明其有分解色氨酸的能力；K7、M7和F7株有產蛋白酶能力；在甲基紅實驗中僅有C2和F7為陽性，說明其有分解糖原產生酸性產物的能力；7株分離菌均有產淀粉和分解硫氨基酸的能力。

表1 生化特性結果

2.4 生物特性結果

2.4.1 分離菌生長曲線 如圖4所示，將7株菌在37 ℃震蕩搖床內進行擴培，取0 h時的D600 nm值作為基準，當培養到達8 h，除K7外，其余6株菌的D600 nm值均上升，細菌進入對數生長期，在24 h時為對數生長期頂峰，隨后進入平臺期。而K7菌株在37 ℃培養下，4 h后，濃度開始快速升高，進入對數生長期，而在36 h時為對數生長期頂峰，隨后進入平臺期。

圖4 分離菌生長曲線Fig.4 Growth curve of the isolated bacteria

2.4.2 耐酸性結果 如圖5所示，7株菌在pH=3.0時生長情況均不是很好。而當pH調至4.0時，K7和M7的生長情況明顯好轉，其D600 nm值達到1.284和1.351，分別達到其最大分光度的72%和70%。而S7、C2和F7菌株在pH=4.0時的生長情況依舊沒有太大的改善，說明這3株菌對酸性的耐受性較弱。

2.4.3 耐堿性結果 由圖6可知，C2在pH=7.0時D600 nm值在7株菌中最高，基本與最適生長情況下的存活率相當。而L7在pH=8.0時的D600 nm值雖在7株菌最低，但卻達到了其自身生長的最大值。S7在pH=7.5時D600 nm值達到了其自身的最大值，當pH進一步升高時，其生長受到了明顯的抑制的作用，說明其對堿的耐受性較弱。

2.4.4 耐膽鹽試驗結果 由圖7可知，T7在不同膽鹽濃度的情況下的D600 nm值的趨勢最為平緩，說明該菌對膽鹽的耐受能力較強。C2的趨勢也較為平緩，而M7和S7的曲線趨勢較陡峭，以M7的曲線變化趨勢最為明顯。S7在膽鹽濃度達到1.5%時，其D600 nm值為1.629，而膽鹽濃度為0時其D600 nm值為1.802。證明該2種菌對膽鹽較為敏感，不易在高濃度膽鹽的條件下存活。

圖5 耐酸性曲線圖Fig.5 Acid resistance curve

圖6 耐堿性曲線圖Fig.6 Alkali resistance curve

圖7 耐膽鹽曲線圖Fig.7 Bile salt tolerance curve

3 討 論

本試驗通過采集10頭健康奶牛瘤胃液進行稀釋涂布篩選和提純等，然后通過16S rDNA測序鑒定確定了7種分離菌。根據系統進化樹和相似性分析基本可以確定L7為解淀粉芽孢桿菌。且通過生化實驗可得知，L7能夠產淀粉酶，這與王世偉等[4]對解淀粉芽孢桿菌進行的產酶能力結果相符。L7還有較強的耐堿性和膽鹽不耐受性。這也與張曉靜等[5]的試驗結果相同。

C2可確定為地衣芽孢桿菌，在近幾年作為飼料添加劑被廣泛應用，如周振峰[6]在奶牛飼料中添加地衣芽孢桿菌，獲得了較好的臨床效果。研究表明飼用地衣芽孢桿菌具有頡頏腸道病原菌，維護和調節腸道微生態平衡的作用，增強動物機體的抗病力和免疫力，可有效提高飼料轉化率，可作為抗生素的替代產品[7]。本試驗結果顯示，C2對堿性耐受性較強，對膽鹽也有很強的耐受性，與張菊等[8]對地衣芽孢桿菌的酸堿性研究結果相似,說明該菌在后續的研究中可能難以實現在腸道內定植。

K7為枯草芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌為飼料中最常見的微生物添加劑，沒有危害性，且可以改善飼料的適口性和腸道的淋巴系統[9]。在本試驗中可以看出其有較強的耐酸性，與盧冰霞等[10]的研究結果相符，也與其可以通過口腔進入瘤胃內活動相印證[11]。

本研究結果表明，分離菌F7為弗氏酸檸檬桿菌、T7為吉氏庫特菌、S7為嗜麥芽窄食單胞菌、M7為馬鏈球菌。弗氏檸檬酸桿菌群、吉氏庫特菌、嗜麥芽窄食單胞桿菌和馬鏈球菌是動物體內常見的致病菌。弗氏檸檬酸桿菌是人和動物體內的正常菌群[12]，雖然在一般情況下不會造成機體感染癥狀，但當其菌群失調或寄生環境改變時，會導致如腹瀉、胰腺炎、腹膜炎和肺炎等[13-15]。本研究中發現，F7對酸堿性以及膽鹽都較為敏感，可通過該方法對其進行有效抑制。馬鏈球菌屬于蘭氏分群的C群β溶血鏈球菌,是引起馬腺疫[16]的主要原因，且能夠引起上呼吸道黏膜炎癥和扁桃體發炎等疾病，由于感染部位的不同，也可能會引起乳房炎發生[17]。本研究發現，分離菌M7在弱酸情況下生長狀態較好，強酸時受到明顯抑制，與孫丹嵐等[18]的研究結果相符。在后續的研究中，可以通過改善動物體內的酸堿度從而對馬鏈球菌進行抑制。

本研究結果表明，T7和S7分別為吉氏庫特菌和嗜麥芽窄食單胞桿菌，而這兩種菌在之前的研究較少。本研究發現，這2株菌對酸的耐受程度較弱，在pH降低至4.0時已經有了較為明顯的抑制作用。可為以后在針對這2株菌引發疾病時，提供一定的解決思路。且S7對膽鹽的耐受性也較弱，可以通過提高膽鹽濃度來達到對該菌株的抑制作用。

功能菌在動物體內發揮著毋庸置疑的作用，而功能菌在疾病治療中仍然存在一些問題需要解決。如是否可以在體內長期存在、是否占有固定的生態位、是否可以通過分離培養及鑒定的方法將特定動物體內原有生態位上的功能菌進行大量繁殖，通過轉化提高動物產品，以此用作動物的日常保健及疾病的治療，這可能會成為未來科學化養殖的一個焦點。本研究通過對瘤胃源功能益生菌的研究，充分了解各種菌的特性，為以后利用復合益生菌制劑[19]、促進瘤胃中微生物繁衍，維持瘤胃內的微生態平衡，提高對營養物質的消化利用率，促進飼料的進一步消化和營養吸收，增強奶牛抵抗能力，降低奶牛患病率，起到基礎的保障作用[20]。

4 結 論

本研究從奶牛瘤胃液中分離出了7種細菌，分別為嗜麥芽窄食單胞菌、吉氏庫特菌、馬鏈球菌、解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、弗氏酸檸檬桿菌和地衣芽孢桿菌。分離菌M7和K7對酸有較強的耐受性，而S7、C2和F7對酸性較為敏感，C2對堿的耐受性最強，而T7對膽鹽的耐受性最強，S7對膽鹽最不耐受。