豬肌內脂肪沉積相關基因的篩選及其表達特性分析

楊 帥，史明月，李文霞，員佳樂，孫 迪，路 暢，楊 陽，蔡春波，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清

(山西農業大學動物科學學院，太谷 030801)

脂肪沉積是一個受多種因素調控的復雜過程，脂肪組織尤其是肌內脂肪組織對于畜禽肉品質的改善有重要影響。肌內脂肪(intramuscular fat，IMF)又被稱為大理石紋脂肪組織，位于肌纖維旁及肌束膜結締組織，主要由甘油三酯(triacylglycerol，TG)和磷脂構成，其含量影響肉的嫩度、多汁性和風味，IMF含量低會導致肉質口感變干[1-2]。豬肉IMF含量在2.0%～3.0%時，胴體瘦肉率適中，肌肉呈現較為理想的大理石紋，嫩度顯著提高，口感也有所改善[3-4]。豬IMF含量受遺傳、環境因素、營養水平等多種因素影響。其中，遺傳因素對不同品種IMF含量起決定性作用，涉及脂質和碳水化合物代謝、細胞信號轉導、刺激反應及組織的基因表達水平等多種調控途徑[5-6]。 脂肪細胞作為脂肪組織的主要組成單位，其增殖和分化在脂肪沉積過程中具有重要作用[7]。

轉錄組測序可精確獲得某一物種在特定條件下所有轉錄產物的表達狀況[8]。利用高通量測序計算mRNA表達量，結合生物信息分析可高效獲得性狀相關基因的表達模式與功能差異[8]。目前，轉錄組測序已廣泛應用于畜禽重要經濟性狀相關的分子機理研究。Muoz等[9]通過對伊比利亞豬背最長肌進行轉錄組分析，獲得了VDR、ATF6、ARID5B、CREB1、SP1 5個參與脂肪形成的調控因子。Xu等[10]比較約克夏豬和魏豬背最長肌轉錄組測序數據，篩選到717個差異表達基因，獲得了FABP3、PDK4、ACSL1和UCP3共4個與脂肪代謝相關的候選基因。吳垚群等[11]對松遼黑豬和長白豬背最長肌進行轉錄組測序分析，篩選獲得DGKα、FGF1、BTD、HLCS、LPIN1、FGFR1和ZNF7共7個參與脂質代謝的候選基因。

馬身豬是山西省地方優良豬種，分布于山西北部偏寒地區，體質健壯，抗逆性強，肉品質好；大白豬為引進品種，瘦肉率高，生長速度快[12]。Zhao等[13]研究表明，相同飼養管理水平下，馬身豬終末體重低于大白豬，但背部皮下脂肪厚度和IMF含量高于大白豬，且肌內脂肪細胞數量多，成脂終末分化能力強。目前，關于馬身豬和大白豬IMF含量差異形成的分子機理尚未明確。本研究以馬身豬和大白豬為試驗動物，基于轉錄組測序比較兩品種背最長肌差異基因，通過GO、KEGG和GeneCards等生物信息學分析，篩選可能影響IMF沉積的差異基因，并對其表達特性進行分析，為闡明馬身豬和大白豬IMF沉積差異機理和改善肉品質提供一定的理論借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 180日齡馬身豬(MS)與大白豬(LW)均由山西省大同市種豬場提供。選取健康的馬身豬和大白豬各3頭，相同條件下飼養，于180日齡時屠宰。分別采集同一部位背最長肌組織、腹部和背部皮下脂肪組織，凍存管分裝后置于液氮中凍存，隨后于-80 ℃保存備用。豬肌內脂肪細胞由山西農業大學動物遺傳育種實驗室提供。

1.1.2 主要試劑及儀器 TRI Reagent?購自Sigma公司；TruSeqTMStranded Total RNA Library Prep Kit購自Illumina公司；ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒、AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；油紅O染色液購自北京索萊寶科技有限公司。全自動樣品快速研磨儀(JXFSTPRP-24L)購自上海凈信有限公司；BIO-CFX熒光定量PCR儀(BIO-CFX96 Touch)購自Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 轉錄組測序及原始數據質控 使用TRI Reagent?提取背最長肌組織樣總RNA。使用TruSeqTMStranded Total RNA Library Prep Kit將質量合格的RNA分別混池，構建鏈特異性文庫。使用Illumina HiSeq 2500平臺完成高通量測序[14]。

1.2.2 差異基因篩選與分析 基于FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped)值，參考錯誤發現率(false discovery rate，FDR)和差異倍數(FoldChange，FC)，利用Edge R包進行基因差異表達分析，設置閾值為FDR<0.05和log2|FoldChange|≥1；利用PheatMap R包分析樣品間差異基因的分布；利用Cluster Profiler R包進行GO功能富集分析；利用OmicShare云平臺進行KEGG通路注釋；利用GeneCards查詢差異基因功能。

1.2.3 肌內脂肪細胞培養及成脂誘導 復蘇豬肌內脂肪細胞，待細胞密度達99%時，在生長培養基中添加100 μmol/L吲哚美辛、5 μmol/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX和1 μmol/L DEX誘導成脂分化；48 h后，更換生長培養基，并添加5 μmol/L胰島素；分別收集成脂分化0、1、3、5及7 d的細胞樣品，油紅O染色依據試劑盒要求進行，染色結束后利用倒置顯微鏡觀察拍照。

1.2.4 反轉錄及引物設計 分別提取2個品種豬背最長肌組織，背部和腹部皮下脂肪組織，以及成脂分化0、1、3、5、7 d的肌內脂肪細胞總RNA。使用ReverTra Ace qPCR RT Master Mix試劑盒反轉錄合成cDNA，-20 ℃保存備用。在NCBI上查找目的基因mRNA序列，并設計實時熒光定量PCR引物，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列信息

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 以β-actin為內參基因，使用AceQ?Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒和BIO-CFX熒光定量PCR儀檢測差異基因的表達量。PCR擴增體系10 μL：模板cDNA 1 μL，SYBR qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物0.8～1 μL，RNase-free ddH2O補足體系。PCR擴增程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，退火(退火溫度見表1)20 s，共45個循環；95 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，采集熔解曲線。每個樣本取3個生物學重復，基因相對表達水平采用2-△△Ct法計算。

1.3 統計分析

采用SPSS 21.0軟件的單因素方差分析和獨立樣本t檢驗分析差異顯著性。結果采用平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著;P<0.01表示差異極顯著。

2 結 果

2.1 差異表達基因篩選及聚類分析

基因表達水平基于FPKM值衡量，共篩選到280個差異表達基因。馬身豬相對于大白豬，有152個基因表達下調，有128個基因表達上調(圖1)。隨機挑選35個基因進行層次聚類分析，結果表明，馬身豬和大白豬各自的3個生物學重復樣本高度聚類，樣品間相關性較高(圖2)。上調和下調基因明顯分為2個基因簇，且分布與測序結果吻合，表明所用樣本分組合理，重復性較好。

圖1 差異表達基因火山圖Fig.1 Volcano plot of differentially expressed genes

圖2 35個差異表達基因聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 35 differentially expressed genes

2.2 差異表達基因GO功能富集分析

由圖3可知，被注釋到的差異表達基因共參與了46個GO條目，在生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)分類中，包含的亞類分別為24、8和14個。在生物過程分類中，參與細胞過程、代謝過程和生物過程調控的差異表達基因最多，分別為138、111和112個，與肉品質相關聯的發育過程也有差異表達基因被注釋；在分子功能分類中，結合和催化活性占比最高，富集的差異表達基因數為152和69個，其次是分子功能調節、轉錄活性調節和抗氧化活性等；在細胞組分分類中，差異表達基因主要參與細胞、細胞部分和細胞器，數目分別為143、143和118個。其中，富集于脂質代謝相關生物過程的GO條目中共有13個差異表達基因(表2)。

2.3 差異表達基因KEGG通路富集分析

KEGG通路富集分析表明，差異表達基因顯著富集到12條信號通路，選取前10條顯著KEGG通路進行展示，其中，TGF-β信號通路(5.1%)為上調差異表達基因富集最多的通路，PI3K-Akt信號通路(2.3%)為下調差異表達基因富集最多的通路(圖4)。PPAR信號通路、MAPK信號通路、脂肪細胞因子信號通路與IMF沉積相關，包括PLIN5、SLC27A6、FABP3、TRAF2、SOCS3、DUSP1和NR4A1等基因(表3)。

2.4 脂肪沉積相關差異表達基因鑒定及其在2個品種豬不同部位脂肪組織中的表達特性

利用GeneCards在線數據庫對上述基因的功能進行分析，共篩選獲得TRAF2、DUSP1、ACOT4、NR4A1、SLC27A6和PLIN5 6個與脂肪沉積相關的基因(表4)，其中，ACOT4、SLC27A6、PLIN5基因為上調基因，TRAF2、DUSP1、NR4A1基因為下調基因。實時熒光定量PCR分析結果表明，在2個品種豬背最長肌中，馬身豬NR4A1和DUSP1基因表達量顯著或極顯著低于大白豬(P<0.05；P<0.01)，而馬身豬PLIN5基因的表達量極顯著高于大白豬(P<0.01)，TRAF2、ACOT4和SLC27A6基因在2個品種豬背最長肌中的相對表達量差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

NR4A1和PLIN5基因在馬身豬背部皮下脂肪組織中的表達量極顯著低于腹部皮下脂肪組織(P<0.01)，DUSP1基因表達量差異不顯著(P>0.05)；在大白豬背部皮下脂肪組織中，NR4A1、DUSP1和PLIN5基因表達量極顯著或顯著高于腹部皮下脂肪組織(P<0.01；P<0.05)。2個品種相比，大白豬背部皮下脂肪組織NR4A1、DUSP1和PLIN5表達量極顯著高于馬身豬(P<0.01)，腹部皮下脂肪組織NR4A1和DUSP1基因表達量顯著高于馬身豬(P<0.05)，PLIN5基因表達量差異不顯著(P>0.05)(表5)。

圖3 差異表達基因GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis of differentially expressed genes

表2 脂質代謝相關GO條目

圖4 差異表達基因KEGG通路富集Fig.4 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed genes

表3 脂質代謝相關KEGG條目

表4 脂代謝相關基因

*，差異顯著(P<0.05)；**，差異極顯著(P<0.01)；ns，差異不顯著(P>0.05)。表5同*，Significant difference (P<0.05)；**，Extremely significant difference (P<0.01)；ns，No significant difference (P>0.05).The same as table 5圖5 馬身豬和大白豬背最長肌差異表達基因相對表達量Fig.5 Relative expression of differentially expressed genes in longissimus dorsi muscle between Mashen and Large White pigs

表5 差異表達基因在2個品種豬背部和腹部皮下脂肪組織中的相對表達量

續表

2.5 脂肪沉積相關差異表達基因在肌內脂肪細胞成脂分化過程中的表達特性

利用實時熒光定量PCR分析脂肪沉積差異表達基因在豬肌內脂肪細胞成脂分化過程中的表達特性(圖6)，結果顯示，隨著成脂分化的進行，NR4A1基因表達量呈降低趨勢，與0 d相比，成脂分化1～7 d表達量顯著降低(P<0.05);DUSP1和PLIN5基因表達量呈上升趨勢，且在第5天表達量明顯升高，顯著高于0 d(P<0.05)(表6)。

圖6 豬肌內脂肪細胞(A)及脂滴油紅O染色(B)(40×)Fig.6 Porcine intramuscular adipocytes (A) and lipid oil red O staining (B)(40×)

表6 成脂分化過程差異表達基因表達變化

3 討 論

IMF是影響豬肉品質的主要因素之一，脂肪組織的形成是包括脂肪分解和脂肪生成的動態過程。本研究基于IMF含量差異較大的馬身豬和大白豬的背最長肌轉錄組測序數據篩選差異表達基因，通過對差異表達基因進行GO功能和KEGG通路富集分析，篩選出與脂質代謝相關的基因，結合利用GeneCards對相關基因功能查詢的結果，獲得了TRAF2、DUSP1、NR4A1、SLC27A6、PLIN5和ACOT4共6個與脂肪沉積相關的基因。其中，NR4A1、DUSP1及PLIN5基因在馬身豬和大白豬背最長肌中的表達量存在顯著差異，而TRAF2、ACOT4和SLC27A6基因表達量在兩品種間差異不顯著，推測NR4A1、DUSP1及PLIN5基因是影響豬IMF沉積的候選基因。

NR4A1是NR4A亞家族成員，常作為轉錄因子參與相應基因的表達，也可與同家族成員NR4A2和NR4A3協同作用于細胞增殖、分化和代謝等過程[15-16]。NR4A1間接上調p53表達水平，抑制固醇調節元件結合轉錄因子1(sterol regulatory element binding transcription factor 1，SREBP1)及其下游脂肪生成相關酶脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，FAS)、硬脂酰輔酶A去飽和酶1(stearoyl-CoA desaturease1，SCD1)和甘油-3-磷酸?；D移酶線粒體(glycerol-3-phosphate acyltransferase mitochondrial，GPAM)的表達，降低機體TG含量[17]，也可與GATA結合蛋白2(GATA binding protein 2,GATA2)直接互作抑制過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARγ)表達，抑制脂肪細胞成脂分化[18]。趙偉明等[19]研究發現，安格斯牛背膘脂肪NR4A1基因表達量低于西門塔爾牛，而安格斯牛IMF含量顯著高于西門塔爾牛，表明NR4A1基因表達量低有利于IMF沉積。本研究中，脂肪型豬種馬身豬背最長肌中NR4A1基因表達量顯著低于瘦肉型豬種大白豬，而馬身豬IMF含量顯著高于大白豬[13]，說明NR4A1可抑制豬IMF沉積，與前人研究結果一致[17-19]。在脂肪前體細胞成脂分化過程中，隨著成脂分化的進行，NR4A1基因表達量逐漸降低，進一步表明NR4A1基因對成脂分化起負調控作用。大白豬背部皮下脂肪組織中NR4A1基因表達量高于腹部皮下脂肪組織，而馬身豬中呈相反趨勢，可能與豬種的經濟類型及不同部位脂肪組織的細胞組成及成脂機制有關，具體原因仍需進一步研究。

DUSP1作為磷酸酶，主要通過蘇氨酸、酪氨酸殘基選擇性滅活胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinases,ERKs)、p38和c-Jun N-端激酶(c-Jun N-terminal kinases，JNKs)3種MAPK信號的活性[20]。相關研究表明，抑制ERK1/2磷酸化，能夠促進PPARγ和CCAAT增強蛋白結合蛋白α(CCAAT enhancer binding protein alpha，CEBPα)的表達，促進TG和脂肪酸結合蛋白(fatty acid binding protein 2，Ap2)的積聚，正調控成脂分化過程[21]。但也有研究發現，ERK1/2信號在成脂分化過程中存在正負調控，p38信號也存在正負調控[22]。而以JNK為核心的JNKs信號被抑制后，成脂關鍵基因CEBPα轉錄活性升高，Ap2表達量增加，促進成脂分化過程[23]。Li等[24]研究發現，在高背脂和低背脂沂蒙黑豬肝臟中與氧化應激相關的DUSP1基因存在差異表達，而肝臟中的氧化應激能夠調節脂質代謝，顯著影響豬IMF沉積。本研究中，DUSP1基因在馬身豬中的表達量低于大白豬，在大白豬背部和腹部皮下脂肪組織中的表達量存在顯著性差異，而在馬身豬兩種脂肪組織中表達差異不顯著，表明DUSP1基因的低表達有利于馬身豬的脂質沉積，可將DUSP1作為影響脂質沉積的候選基因。但在肌內脂肪細胞成脂過程中，DUSP1基因表達呈明顯上升趨勢，這與活體表達情況不一致。DUSP1基因主要通過MAPK信號發揮功能，其對成脂過程的調控除了受遺傳因素影響外，在個體水平還受年齡等因素影響，且在不同發育階段功能不同，從而導致其在細胞和個體水平表達的不一致。

PLIN5是一種覆蓋于細胞脂滴表面的磷蛋白，多分布于心臟、肝臟、棕色脂肪和骨骼肌等脂肪酸氧化代謝活躍的組織，調節相應組織的脂質代謝過程[25]。PLIN5作為關鍵脂滴蛋白受PPARγ調控，通過降低脂肪酸氧化或抑制TG脂解，促進機體內脂質的沉積[26-27]。在小鼠骨骼肌中，缺失PLIN5基因會導致氧化型肌纖維中的TG脂解，加快脂肪酸氧化速率；而過表達PLIN5基因后，肌細胞脂滴中TG含量增加[28]。同時，PLIN5也可通過調控線粒體生物合成和氧化相關基因的表達，促進TG水解[29]。Puig-Oliveras等[30]研究發現，在伊比利亞豬和長白豬背最長肌中PLIN5基因存在差異表達，且與肌肉脂肪酸代謝相關。本研究中，隨著成脂分化的進行，PLIN5基因表達明顯升高，與PLIN5基因促進脂質沉積的功能相一致。在相同飼養條件下，馬身豬背最長肌和腹部皮下脂肪組織PLIN5基因表達量顯著高于大白豬，也與馬身豬成脂能力強的種質特性相吻合。此外，馬身豬主要生活在山西北部高寒地區，溫度較低，其機體線粒體生物合成與利用高于大白豬，這也有利于其生存和IMF沉積。眾所周知，皮下脂肪與IMF的發育是相互獨立的，皮下脂肪的過度沉積會導致肉品質降低，而IMF含量與肉品質呈正相關，本研究中PLIN5基因在馬身豬背部皮下脂肪的表達量低于大白豬，這也可能是馬身豬肉品質優于大白豬的原因之一。

本研究中，TRAF2、ACOT4和SLC27A6基因分別被注釋到脂質代謝相關的GO和KEGG條目，但在2個品種豬背最長肌中表達量差異不顯著。TRAF2主要通過激活細胞核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信號參與細胞的增殖、凋亡及免疫應答反應過程[31]；ACOT4與磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，p-Akt)/葡萄糖轉運蛋白4(glucose transporter 4，GLUT4)途徑有關[32]，表明TRAF2和ACOT4的主要功能對IMF沉積影響較小。SLC27A6主要參與機體內特定脂肪酸的轉運[33]。Chen等[34]研究發現，在高大理石紋的牛背最長肌中SLC27A6基因表達水平較高，表明SLC27A6基因參與牛IMF沉積過程。本研究中，在2個品種豬背最長肌中SLC27A6基因表達量差異不顯著，表明在不同物種中SLC27A6基因對脂肪沉積的調控可能存在差異。

4 結 論

本研究篩選到NR4A1、DUSP1及PLIN5 3個與豬脂肪沉積相關的候選基因，其中，馬身豬NR4A1基因表達量顯著低于大白豬，在脂肪細胞成脂分化過程中其表達量呈降低趨勢，其對豬脂肪沉積有負調控作用；馬身豬PLIN5基因表達量極顯著高于大白豬，且在脂肪細胞成脂分化過程中PLIN5基因表達量呈上升趨勢，其對豬脂肪沉積有促進作用；DUSP1基因在馬身豬中的表達量極顯著低于大白豬，而在脂肪細胞成脂分化過程中DUSP1基因表達量呈上升趨勢，其對脂肪沉積的功能在活體和細胞上表現不同。