白木香種質資源ISSR標記的遺傳多樣性分析

何夢玲，林 丹，李嘉惠，歐曉華，劉曉瑩，高曉霞，馬文哲，張宏意，嚴寒靜*

? 藥材與資源 ?

白木香種質資源ISSR標記的遺傳多樣性分析

何夢玲1, 2，林 丹1，李嘉惠1，歐曉華1，劉曉瑩1，高曉霞3，馬文哲4，張宏意1, 2，嚴寒靜1, 2*

1. 廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006 2. 國家中醫藥管理局中藥材生產與開發重點實驗室，廣東 廣州 510006 3. 廣東藥科大學藥學院，廣東 廣州 510006 4. 廣東農工商職業技術學院，廣東 廣州 510507

白木香是中國特有的、具有極高經濟價值的珍稀瀕危藥用植物，由于人類對其自然資源的長期過度開發和生態破壞，白木香現僅有零星散生的野生資源，為更好地保護和利用白木香，現對其進行遺傳多樣性分析。采集了中國14個地區的232份白木香樣本，并利用ISSR標記對其進行遺傳多樣性評價。ISSR標記具有較高的多態性（100%），表明ISSR是檢測白木香遺傳多樣性的有效方法。對所有樣本進行遺傳分析，在相似系數為0.71時，可將其聚為4個類群。期望雜合度（H）、Shannon’s信息指數（）在XL群體中最高，而61.84%的遺傳變異發生在群體之間。種群結構分析表明，14個種群能夠按照區域和來源進行嚴格劃分，說明種群間的基因交換很少。白木香種源有較好的遺傳多樣性，但野生資源大幅減少，需加強白木香資源的保護、繁育和利用。

沉香；白木香；ISSR；遺傳多樣性；資源保護

白木香(Lour.) Gilg來源于瑞香科，主要分布于我國廣東、廣西、海南、云南、香港及澳門等地[1]，其莖干受傷后產生的含樹脂的木材即是我國和東南亞國家的傳統名貴藥材——沉香。沉香性微溫，味辛、苦，歸脾、胃、腎經，具有行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之效，主治胸腹脹悶疼痛、胃寒嘔吐呃逆、腎虛氣逆喘急等疾病[2]，并為治胃病特效藥[1]，白木香是國產沉香的唯一植物來源，也是“十大廣藥”之一，具有很高的經濟價值。隨著市場對沉香需求量的增長，沉香價格不斷攀升，人們對白木香野生資源展開無節制的開發和掠奪性的采伐，致使白木香的生存環境嚴重惡化，種群更新受阻，野生資源加速枯竭[3]。然而，由于長期的生境破壞和過度開發，白木香數量迅速減少，已被列為珍稀瀕危三級保護植物[4]。

ISSR是一種基于SSR的分子標記技術。與SSR標記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，不像SSR標記一樣具有較強的種特異性，而且揭示的多態性較高，檢測非常方便。ISSR標記已廣泛應用于植物品種鑒定[5]、遺傳作圖[6]、中藥真偽鑒定[7]、遺傳多樣性[8-9]等研究中，為藥用植物的保護和發展提供了重要的參考。

本研究利用ISSR標記分析14個種群232份樣本的遺傳多樣性，以期為白木香種質資源的保存和開發利用提供實驗基礎。

1 材料與儀器

1.1 材料

供試材料為采自廣東、海南、云南3省地理相對隔離的14個居群的白木香種質，共計232份，經廣東藥科大學嚴寒靜教授鑒定為白木香(Lour.) Gilg，樣品來源信息如表1所示。從每株白木香樹上釆集10～20片生長良好、無病蟲害的白木香葉片，硅膠干燥并放入?20 ℃冰柜中保存備用。

表1 白木香種質資源地理信息

Table 1 Geographic information of 14 populations of A. sinensis

樣品編號數量采集地點緯度（N）經度（E） MM1-1010廣東茂名電白區沉香山21.69°111.18° ZS1-2020廣東中山五桂山生態保護區22.52°113.38° CC1-2222廣東惠州博羅縣泰美鎮車村23.30°114.51° XL1-2222廣東惠州惠東縣巽寮灣22.69°114.76° GQ1-9 9廣東惠州惠陽區沙田鎮岡齊嶺22.85°114.58° SZ1-2323廣東深圳銀湖山郊野公園22.58°113.08° YC1-6 6廣東陽江陽春市春灣鎮幸福村22.37°112.02° DH1-4 4廣東肇慶鼎湖山23.18°112.54° DG1-2424廣東東莞大嶺山沉香基地22.91°113.78° YZS1-1313海南省?？谑腥f寧藥植所19.99°110.25° SJ1-1414海南省?？谑忻捞m區三江鎮19.86°110.61° BWL1-2222海南省昌江黎族自治縣霸王嶺19.10°109.20° NYY1-2222云南省景洪市南藥園22.01°100.79° MS1-2121云南省景洪市勐宋鄉滿金山22.13°100.68°

1.2 試劑與儀器

植物基因組DNA提取試劑盒（GMbiolab Co.，TW），PCR premix購自Takara（T）或Zoman（Z）。DL-600C型電泳儀（北京東林昌盛生物科技有限公司）；BG-subMIDI型水平電泳槽（北京百晶生物技術有限公司）；Nanodrop ND-1000型分光光度計（Thermo公司，美國）；3K15型臺式高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；MJ-54A型高壓蒸汽滅菌鍋（美國施都凱儀器設備有限公司）。

2 方法

2.1 白木香基因組DNA的提取與檢測

從每份白木香樣品中取100 mg葉片，經液氮冷凍后研磨成粉末，使用植物基因組DNA提取試劑盒依次提取白木香基因組DNA。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的質量，并在260 nm/280 nm和230 nm/260 nm波長下檢測DNA的濃度和純度，符合要求的樣品于?20 ℃下保存備用。

2.2 ISSR-PCR反應和檢測

PCR擴增體系（20 μL）中，各因素濃度為：DNA模板10 ng/20 μL，引物（5 μmol/L）1.5 μL，dNTP 0.6 mmol/L，Mg2+3 mmol/L，Taq DNA聚合酶2.4 U/20 μL，引物0.2 μmol/L。

PCR擴增程序為：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性30 s，引物m值下退火45 s，72 ℃延伸2 min，進行34個循環，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存。

PCR結束后，取5～6 μL PCR產物加入2%瓊脂糖凝膠點樣孔中，電泳緩沖液為1×TAE，將凝膠在100 V恒定電壓下電泳45 min，染色，隨后在凝膠成像系統下觀察。

2.3 ISSR多態引物的篩選

選擇加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布的100條ISSR通用引物進行篩選，以獲得多態性好、穩定的ISSR引物。同時篩選了各引物適合的PCR Premix和適合的退火溫度。

2.4 數據分析

使用Quantity One分析軟件識別和計算瓊脂糖凝膠電泳圖上各泳道條帶的有無及其遷移率，根據分析結果給條帶賦值，條帶清晰穩定記為“1”，條帶模糊或無條帶則記為“0”，于Excel 2010中建立二元數據矩陣，用于進一步數據分析。

運用NTSYS-PC統計軟件計算相似系數（DICE系數），并且按照遺傳距離進行UPGMA聚類分析，通過Dcenter變換得到二維主坐標分析圖（PCoA）。利用軟件STRUCTURE v.2.3.4對白木香種質資源進行群體結構分析。

運用POPGENE 32 ver.1.32軟件計算擴增產物的觀測等位基因數（a）、有效等位基因數（e）、Nei’s遺傳多樣性（）、Shannon’s信息指數（）、多態性位點數、多態位點百分率、遺傳一致性和遺傳距離等參數。此外，利用群體間總遺傳多樣性（t）、群體內平均遺傳多樣性（s）、遺傳分化系數（st）和基因流（m）對白木香的種群結構和種群規模進行了評價。

3 結果與分析

3.1 多態引物篩選及多態性分析

隨機選擇3個省份的3份白木香種質資源基因組DNA作為模板，對100條ISSR引物進行篩選，最終篩選出12條穩定性高，重復性好、條帶清晰的引物。

利用這12條ISSR引物對232份種質資源進行遺傳多樣性研究，共擴增出357條條帶，每條引物檢測到的條帶數介于18～49，平均每條引物檢測到的條帶數為30條，條帶片段大小基本上集中在200～2500 bp。擴增條帶數最多的引物為UBC856，多達49條，擴增條帶數最少的為UBC826和UBC887，僅有18條。357條條帶均為多態性條帶，多態性條帶比率為100%。每條引物的篩選結果見表2。

表2 12條引物的篩選結果

Table 2 Sequences and amplification results of 12 ISSR primers

引物引物序列(5’-3’)擴增出的條帶數多態性條帶數PCR premix退火溫度/℃ UBC807(AG)8 T3232T48.5 UBC808(AG)8 C2929T53.0 UBC809(AG)8 G3636Z52.0 UBC810(GA)8 T3131Z51.2 UBC811(GA)8 C2020Z52.0 UBC826(AC)8 C1818T51.2 UBC827(AC)8 G2121T47.9 UBC834(AG)8YT4343Z53.3 UBC840(GA)8 YT2222T49.9 UBC856(AC)8 YA4949Z55.5 UBC886VDV (CT)73838T49.8 UBC887DVD (TC)71818T49.8 平均值 29.7529.75?? 總計 357357??

T-Takara公司的PCR引物 Z-Zoman公司引物

T-PCR premix from Takara Z-PCR premix from Zoman

3.2 基于ISSR分子標記的白木香遺傳多樣性分析

14個居群白木香的遺傳多樣性指數見表3。t為0.260 5±0.016 5，s為0.112 7±0.016 5。st為0.567 6（＞0.5），表明種群間存在高度的遺傳分化。m為0.381 0，說明種群間基因流動較弱。

值在0.089 6～0.147 9（表3）。在14個種群中，巽寮灣（XL）的多態性最高（43.98%），鼎湖山（DH）和深圳銀湖山（SZ）最低（23.53%）。種群大小與遺傳多樣性和百分比多態性無顯著相關。6個群體的遺傳多樣性指數均高于平均水平，分別是巽寮灣（XL）、車村（CC）、東莞大嶺山（DG）、海南藥用植物研究所（YZS）、海南三江鎮（SJ）和云南勐宋鄉（MS）。

表3 14個居群白木香的遺傳多樣性

Table 3 Genetic diversity in 14 populations of A. sinensis

居群樣本數量NaNeHI多態性位點（NPL）多態性位點比率（PPL）/% M101.282 91.175 10.100 70.149 810128.29 ZS201.369 71.187 90.111 50.169 913236.97 CC221.409 01.230 30.135 90.204 214640.90 XL221.439 81.254 80.147 90.221 415743.98 GQ 91.246 51.187 00.102 90.148 5 8824.65 SZ231.235 31.163 20.091 90.134 4 8423.53 YC 61.243 71.176 10.098 00.142 7 8724.37 DH 41.235 31.157 30.089 60.132 3 8423.53 DG241.336 11.208 40.120 80.179 512033.61 YZS131.364 11.215 10.124 30.185 913036.41 SJ141.364 11.205 60.120 40.181 513036.41 BWL221.285 71.194 20.109 50.160 410228.57 NYY221.296 91.179 90.106 20.158 710629.69 MS211.366 91.198 10.117 70.178 213136.69 平均值171.319 71.195 20.112 70.167 711431.97

采用分子方差分析（AMOVA）對白木香群體間的分子變異進行分析（表4），總體遺傳多樣性中，群體間遺傳多樣性為61.84%，群體內遺傳多樣性為38.16%。

表4 白木香群體遺傳變異的AMOVA分析

Table 4 Analysis of molecular variance (AMOVA) for population of A. sinensis

變異來源自由度平方和方差分量變異比例/%P值 居群內218 4 375.6120.07 38.16＜0.001 居群間 13 7 180.1532.53 61.84＜0.001 總計23111 555.7652.60100.00

3.3 聚類分析

利用UPGMA方法進行聚類，并構建出232份白木香種質的系統聚類圖。從圖1中可以看出，遺傳距離的取值范圍從0.66到0.96，當閾值為0.71時，14個白木香居群被聚為4組。將廣東5個居群（MM、CC、XL、GQ和SZ）組成一個聚類，將7個居群（3個海南、3個廣東和1個云南）組成一個大聚類。

此外，當遺傳距離的取值介于0.66～0.68時，云南南藥園NYY的種群聚在一起，而其他210個個體聚成第2支。聚類結果的主坐標分析結果如圖2所示。這表明種群沒有明顯地聚集在一起。

利用STRUCTURE軟件對232個白木香種質資源進行了遺傳結構分析。當＝13時△值最大（圖2）。根據分析結果，當＝13時可以得到合理的種群結構（圖3）。不同的顏色代表不同的組，每條顏色的垂線代表一份材料。種群結構幾乎嚴格按照地區和來源進行劃分。

4 討論

多年生木本植物通常遺傳多樣性值高, 常表現出小群體之間的分化[10]，這一點在本研究中也有體現。白木香的期望雜合度（e）值為0.231 8，高于雙子葉植物的均值（0.190 0）和區域性植物（0.220 0）可能是因為（1）白木香的地理分布在物種多樣性豐富的熱帶和低緯度亞熱帶地區；（2）花期長，主要繁殖方式為異花授粉；（3）果實成熟后，種子懸掛在裂開的果皮上，種子懸掛可以通過重力或昆蟲的長距離取食進行傳播，這些環境因素和自身特性都有助于白木香群體之間進行基因交流。

圖1 232份白木香種質的聚類圖

圖2 K值曲線圖

與其他木本植物的H和相比較，如紅豆杉(Pilger) Rehd.（0.205 8，0.325 9）[11]和黃檗Rupr.（0.224 3，0.262 8）[12]，白木香的和均值分別為0.112 7、0.167 7，反映出白木香種群的遺傳多樣性相對較低。究其原因，可能是白木香的種子屬于頑拗性種子，水分和貯藏溫度高，代謝旺盛，在自然環境中容易脫水和失活。白木香的花期為4月，恰逢雨季，陰雨天氣會導致花粉敗育，阻止昆蟲異花傳粉，增加自花傳粉的概率，減少種群間的基因交換。基因流又稱基因遷移，是基因從一個種群遷移到另一個種群的機制[13]。基因流可以減弱群體間的遺傳差異，提高群體間的遺傳相似性。本研究中白木香的m值只有0.381 0，表明白木香種群間很少基因交流，這一結果和白木香種質的遺傳結構圖一致，各種群間相對獨立。但這一數值小于廣東中山市五桂山土沉香中（0.534）[14]的研究結果，可能因為本研究中白木香種質來源地區較多，野生植株的種子傳播率低，種群之間也有較大地理隔離的原因。

作為一種具有很高經濟價值的珍稀瀕危植物，白木香比其他物種受到更嚴重的人為干擾和破壞，直接導致種群個體數量的急劇減少、居群片段化嚴重和遺傳漂變加劇。一旦下一代個體不產生后代或沒有將所有等位基因傳給后代，就很容易導致某些基因的消失[15]。在本研究中，白木香14個種群的st值為0.567 5，低于大多數被子植物種群的平均水平（st＝0.637）[16]，這一點與賈文杰等[15]和Zou等[17]的結果一致。珍稀瀕危植物由于生存環境狹窄，種群數量少，隨機漂變和近交衰退常導致個體和群體變異性較低，往往表現出較低的遺傳多樣性水平。瀕危會導致遺傳多樣性水平的下降，而低水平的遺傳多樣性會使其更加瀕危。

圖3 232份白木香種質種群結構分析（K＝13）

AMOVA分析顯示群體內遺傳變異為38.16%，群體間遺傳變異為61.84%，這與蔣開彬應用SRAP標記進行研究的結果相反[18]?？赡苁且驗?項研究所用遺傳標記不同的緣故。

STRUCTURE的分析結果表明，白木香的種群結構幾乎嚴格按照區域和來源進行劃分，說明白木香種群之間沒有廣泛的基因交換，這與m值和PCoA分析結果基本一致。究其原因，可能是因為非法砍伐導致白木香個體數量銳減。

因此，對白木香的保護策略應包括就地保護和遷地保護。就地保護應加強對原生境的關注，保持種群的有效規模，避免個體數量的減少，這主要依賴于自然保護區的建立。為擴大白木香種群，有必要組織人力進行種子采集和引種試驗。為了進行遷地保護，需要精心設計保護策略，從不同地點/種群收集種子，并將不同種群的幼苗轉移到合適的生境，以建立該物種的種質庫；從而人為增加種群間的基因流動。廣泛開展科普宣傳教育，提高公眾保護珍稀瀕危樹種及其生存環境的意識。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Evaluation of genetic diversity ofgermplasm resources using ISSR markers

HE Meng-ling1, 2, LIN Dan1, LI Jia-hui1, OU Xiao-hua1, LIU Xiao-ying1, GAO Xiao-xia3, MA Wen-zhe4, ZHANG Hong-yi1, 2, YAN Han-jing1, 2

1. College of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. Key Laboratory of Production & Development of Cantons Medicinal Materials, State Administration of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China 3. College of Pharmacy, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 4. Guandong Aib Polytechnic, Guangzhou 510507, China

, a precious medicinal plant with high economic value, has been driven to the brink of depletion due to the long-term overexploitation of natural resources and ecological destruction by anthropogenic activities. There are only scattered wild resources of. In order to better protect and utilize schistosomiaceae, the genetic diversity ofwas analyzedA total of 232 samples ofwere collected from 14 areas in China and its genetic diversity was evaluated with ISSR markers.High levels of polymorphism (100%) were observed, indicating that ISSR was an efficient method to detect genetic diversity of wild. All samples were genetically analyzed and divided into four major clusters at the similarity coefficient of 0.71. The highestandvalues were observed in XL population and most genetic variations occurred among populations. The analysis of population structure showed that 14 populations were strictly divided by region and source, indicating that there was little gene exchange amongresources.There was a good genetic diversity inresources. Due to the sharp decrease of wild resources, the protection, breeding and utilization ofresources should be strengthened.

agarwood;(Lour.) Gilg; ISSR; genetic diversity; materials protection

R282.12

A

0253 - 2670(2022)11 - 3441 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.021

2021-11-09

國家自然科學基金資助項目（81773829）；廣東省重點領域研發計劃（2020B020221002）；廣東省科技項目（2015A030302084）；廣東省科技項目（2017A030303082）；廣東省科技項目（2017A030303081）；廣東省中管局項目（20163010）

何夢玲，女，博士，副教授，碩士研究生導師，從事中藥資源開發與品質評價研究工作。E-mail: hmldf@126.com

嚴寒靜，女，博士，教授，碩士研究生導師，從事中藥資源開發與品質評價研究工作。E-mail: yanhanjing1211@163.com

[責任編輯 時圣明]