基于斑馬魚模型及分子對接技術研究丹參促進血管生成的關鍵活性成分

宋玉琴，魯梓旭，余 婕，董夢旋，郭 爽，禚方圻，陳昊南，張友剛，韓利文*

基于斑馬魚模型及分子對接技術研究丹參促進血管生成的關鍵活性成分

宋玉琴1, 2，魯梓旭2，余 婕2，董夢旋2，郭 爽2，禚方圻2，陳昊南2，張友剛2，韓利文2*

1. 淄博市食品藥品檢驗研究院，山東 淄博 255086 2. 山東第一醫科大學（山東省醫學科學院）藥學與制藥科學學院，山東 濟南 250000

建立新方法探索丹參中潛在的促進血管生成的活性成分。以綠色熒光蛋白標記血管的轉基因斑馬魚為實驗動物，以血管抑制劑PTK787損傷造模建立血管生成活性評價模型，評價不同產地的丹參提取物對血管生成的促進作用。采用分子對接技術篩選丹參促血管生成的潛在活性成分，結合分子對接篩選結果與斑馬魚活性實驗結果，確認關鍵的活性成分。與模型組比較，不同產地的丹參提取物均能明顯促進斑馬魚節間血管的生成（＜0.01）。通過分子對接篩選發現丹酚酸B與VHL-缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）復合物的對接結合能最低，并初步揭示可能的作用位點。利用斑馬魚模型實驗發現，丹酚酸B具有明顯的促進血管生成作用（＜0.01）。建立了一種基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評價”的中藥藥效物質辨識新方法，將計算化學數據挖掘技術與斑馬魚活性實驗結合，發現了丹酚酸B是丹參中促血管生成的關鍵活性成分之一，為冠心病的防治及后續的新藥研發提供科學依據。

丹參；血管生成；斑馬魚；分子對接；丹酚酸B

冠心病也稱為冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CHD），是由冠狀動脈狹窄、供血不足引起的心肌功能障礙和（或）器質性病變[1]。目前冠心病的治療主要為藥物治療、介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）及冠狀動脈旁路移植術（coronary artery bypass grafting，CABG）[2]。已有研究表明，傳統中藥可通過促進心臟梗死區或缺血區的旁路血管新生來治療CHD[3]。促進血管新生可改善CHD患者的心肌缺血、減緩癥狀發作并能改善預后，降低不良心血管事件的發生率[4-5]。因此，從傳統中藥中篩選發現具有促進血管再生的關鍵藥效成分，對于CHD的防治具有重要價值。

丹參為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，具有活血祛瘀、通經止痛、清心除煩、涼血消癰等功效。現代藥理學研究表明，丹參具有增加冠脈流量[6]、降低心肌興奮性和傳導性、保護心肌缺血性損傷[7]、抗氧化[8-9]、保護心血管[10]、改善腎功能[11]、抗菌消炎[12]、抗腫瘤[13]等作用。丹參的主要化學成分為脂溶性的二萜醌類、水溶性酚酸類及其他類型化合物[14]。雖然目前已有較多丹參藥效成分的研究，但采用新模型、新技術探索丹參中是否存在其他潛在的抗CHD活性成分，依然具有重要價值。

斑馬魚是一種國際新興的新型脊椎模式動物，在血管生成途徑上與人類表現出高度的遺傳和功能的保守性，有87%的基因片段相同[15]。斑馬魚為整體動物，可以觀察到整體表型，與體外細胞模型相比，具有明顯優勢。血管標記熒光的轉基因系的斑馬魚不用染色即可觀察斑馬魚節間血管情況，使得測量血管再生結果更直觀精準[16]。分子對接技術主要是研究受體與藥物分子之間的結合與相互作用，通過受體獨有特征，篩選可能結合的藥物分子以及結合模式和親和力，是當下計算機模擬在藥物研究領域的重要輔助手段[17]。自20世紀70年代中期首次出現以來，分子對接已成為協助藥物設計和發現的獨特計算機模擬工具，如在大型化合物庫中識別新的化學支架[18]，為藥物重新定位、靶點確認、預測不良反應和其他方面進行數據分析[19]。中藥組成成分復雜，通過分子對接技術可以實現活性成分的虛擬篩選，進一步提高篩選的效率，降低篩選成本，已成為新藥發現的重要方法。因此，本研究應用新型模式動物斑馬魚模型和分子對接技術深入研究丹參中促血管再生作用活性的關鍵成分，為候選藥物的發現、資源開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 藥材

共收集2020—2021年不同產地的丹參藥材飲片，詳細信息見表1。所有樣品經山東第一醫科大學韓利文副研究員鑒定為唇形科植物丹參Bge.的干燥根和根莖，保藏于藥學與制藥科學學院中藥資源樣品庫中。

1.2 藥品與試劑

二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號K1723046）購自北京芯硅谷；酪氨酸激酶抑制劑PTK787（批號M1648-04）購自AbMole公司；亞甲基藍（批號619H022）購自北京索萊寶科技有限公司；鏈酶蛋白酶（批號41844523）購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 動物

血管標記綠色熒光蛋白的轉基因斑馬魚（）來自國家斑馬魚資源中心。

1.4 儀器

Z-A-S5型斑馬魚養殖系統（上海海圣生物實驗設備有限公司）；IX83型倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；ZSA0745型體式顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）；LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津）；DFY-1000型搖擺式多功能高速中藥粉碎機（溫州頂歷醫療器械有限公司）；TDZ5型臺式低速離心機（湖南赫西儀器裝備有限公司）；RE-2000A型旋轉蒸發儀（鄭州科泰實驗設備有限公司）；DZF型真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）。

表1 不同產地丹參樣品信息

Table 1 Information of S. miltiorrhiza samples from different origins

編號收集日期產地編號收集日期產地 DS012020-11-08山東菏澤DS062021-02-18 湖北神農架 DS022021-03-13山東日照DS072021-02-23云南文山 DS032020-10-10山東菏澤DS082021-03-16陜西丹鳳 DS042021-03-02山東菏澤DS092021-03-23四川德陽 DS052020-11-12河南禹州DS102021-02-18云南麗江

2 方法

2.1 丹參提取物的制備

不同產地的丹參樣品按照相同方法進行平行提取。丹參樣品用中藥粉碎機粉碎為粗粉，過3號篩；稱取15 g丹參樣品粉末放入500 mL圓底燒瓶中，加入90%乙醇120 mL（料液比1∶8），90 ℃水浴提取，提取2次，每次1.5 h；合并2次上清液，減壓濃縮，真空60 ℃干燥，即得丹參提取物。

隨機選取1個提取物樣本（DS01），準確稱定，置10 mL量瓶中，加入80%甲醇溶解定容，配制成質量濃度為2 mg/mL的溶液。按照《中國藥典》2020年版一部丹參藥材含量測定項下規定，采用島津LC-20A型高效液相色譜儀，以乙腈-0.02%磷酸水溶液為流動相，測定DS12提取物中丹酚酸B的質量分數為21.46%，丹參酮IIA、隱丹參酮、丹參酮I之和為0.29%。

2.2 丹參提取物的斑馬魚耐受實驗

選擇發育至24 h（hours post fertilization，hpf）的斑馬魚受精卵，用脫膜劑鏈酶蛋白酶（1 mg/mL）進行脫膜處理。隨機選取1個提取物樣本（DS01）進行實驗。設置不同質量濃度的丹參提取物（100、200、400、600、800、1000、1500、2000 μg/mL）組和對照組（給予pH 7.1～7.4、溫度26.5～28.5 ℃、電導率490～530 μS、溶解氧質量濃度5.0～7.5 mg/L的養魚水）。于體式鏡下觀察，記錄給藥24 h后斑馬魚畸形與死亡情況，計算死亡率。

采用GraphPad Prism 9統計軟件通過回歸分析計算丹參提取物的最低致死質量濃度，考察斑馬魚對丹參提取物的耐受性。

2.3 丹參提取物對斑馬魚促進血管生成活性的研究

將發育至24 hpf的斑馬魚受精卵用1 mg/mL的脫膜劑鏈酶蛋白酶進行脫膜處理，將脫膜的斑馬魚放入24孔板，每孔10條。模型組中加入0.2 μg/mL PTK787，處理組先加入0.2 μg/mL PTK787后再加入丹參提取物或單體，對照組中加入空白溶劑（0.5% DMSO）。每孔加入養魚水保證每孔體積為2 mL。24 h后于熒光顯微鏡下觀察斑馬魚的節間血管情況并進行拍照，用Image Pro 6軟件測量血管長度，統計節間血管總長度，統計結果用GraphPad Prism 9軟件進行單因素方差分析，＜0.05表明有統計學差異。

2.4 基于分子對接技術篩選丹參促血管生成的活性成分

在TCMSP數據庫（https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php）中以“丹參”為關鍵詞檢索丹參的化學成分，剔除沒有PubChem信息的化合物，將具有PubChem CID的化合物批量導入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫中獲得化合物的sdf結構，構建丹參小分子庫，將獲得丹參小分子庫導入Schrodinger分子模擬包中，利用Ligpre模塊進行2D sdf分子轉化為3D sdf格式，用于后期分子對接的準備。

抑癌基因VHL介導的缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）降解是調控下游血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的重要途徑。因此，在RCSB pdb數據庫（https://www.rcsb.org/）中下載VHL-HIF-1α復合物的晶體結構（PDB：3ZRC），將3ZRC導入Schrodinger的Maesrto10.1進行蛋白前處理，由于3ZRC有多條同源鏈，選擇其中1條包含活性口袋的鏈進行分子對接。蛋白經過protein preparation模塊進行補足缺失殘基以及中性化等操作，最后進行能量最小化并添加OPLS2005力場。

分子對接的活性口袋由3ZRC自帶的配體進行定義，直接選中3ZRC晶體中的配體生成對接盒子，對接盒子參數選擇軟件默認。先進性HTVS（high through virtual screening）模式的高通量篩選，將得到的化合物再次進行SP（standard precision）模式的篩選，根據對接的結果篩選前10個結合能較高的化合物進行可視化。為了驗證對接的可靠性，本研究將3ZRC自帶配體抽出再對接到3ZRC中5次，計算對接結合模式的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）值以評估對接的可靠性。對接的結果分別采用Pymol 2.4.1和Ligplus進行可視化。

3 結果

3.1 丹參提取物在斑馬魚模型的耐受性實驗結果

為了更好地觀察藥物對于斑馬魚的致死效應，將劑量的對數值與死亡率進行回歸曲線擬合。GraphPad Prism 9軟件擬合的結果（圖1）顯示，丹參提取物質量濃度為800 μg/mL時，斑馬魚開始出現死亡；丹參提取物質量濃度為1000 μg/mL時，斑馬魚全部死亡，但在600 μg/mL時就開始出現了斑馬魚發育異常（脊柱彎曲）的情況，表明丹參提取物已經出現了致畸作用，因此本研究中丹參提取物的耐受劑量為400 μg/mL，后續實驗中質量濃度最高設為400 μg/mL。

圖1 斑馬魚幼魚死亡率回歸曲線圖

3.2 丹參提取物促進斑馬魚血管生成的劑量效應

如圖2所示，PTK787處理斑馬魚后，斑馬魚節間血管生長不完整，沒有閉合，與對照組相比節間血管總長度顯著縮短（＜0.01）且無畸形或死亡出現，表明血管損傷模型建立成功。隨機選取1個丹參提取物（DS01）考察樣品在斑馬魚模型上促進血管生成作用的量效關系。發現丹參提取物質量濃度為50 μg/mL時，斑馬魚沒有明顯的血管生長出現；丹參提取物質量濃度為100、150 μg/mL時，斑馬魚開始出現明顯的血管生長，與模型組相比具有顯著性差異（＜0.01）。說明丹參提取物能夠逆轉PTK787造成的斑馬魚血管損傷，且隨著丹參質量濃度的增加，促血管再生作用有增強的趨勢。

與對照組比較：##P＜0.01；與模型組比較：**P＜0.01，圖3、5同

3.3 不同產地的丹參提取物對斑馬魚損傷血管生成的促進作用

如圖3所示，不同產地的丹參提取物（150 μg/ml）均出現了不同程度的促血管生成作用，與模型組相比，均具有顯著性差異（＜0.01）。不同產地的丹參提取物表現出了不完全一致的生物活性，其中DS06樣品促血管生成的活性最低，DS05樣品促血管生成的活性最高。

3.4 分子對接技術分析

從TCMSP數據庫中總共獲得143個具有PubChem信息的化合物，經過Ligpre進行處理轉化成3D結構。在對接模型驗證（Redocking）過程中，進行了5次對接，最終3ZRC自帶的配體（PubChem ID：56684144）均對接到了活性口袋，且5次對接結合能均為?39.079 kJ/mol，RMSD值為0，對接具有非常高的可重復性，證明對接模型的可靠性。

在HTVS對接模式下由132個化合物成功對接到活性口袋，對接結合能?26.865～?2.807 kJ/mol。在SP對接模式下，總共有137個結合能小于0的化合物被成功對接，結合能為?31.091～?0.197 kJ/mol，有3個化合物的結合能大于0 kJ/mol，可能是VHL-HIF1a非抑制劑。表2為排名前10的化合物與3ZRC對接結合能及化合物信息，對接排名最高的化合物為丹酚酸B，結合能為?31.091 kJ/mol。對接結果顯示，3ZRC晶體自帶的共晶陽性配體（positive ligand，PL）剛好與3ZRC蛋白晶體的活性口袋契合（圖4-A），具有很好的重現性。進一步分析發現，PL與活性口袋的TYR-98、HIS-110、SER-111和HIS-115 4個氨基酸殘基形成氫鍵。圖4-B為丹酚酸B與3ZRC對接的模式圖，丹酚酸B主要通過PRO-99、TYR-98、ARG-107和HIS-110 4個氨基酸殘基形成氫鍵并錨定在3ZRC的活性口袋，其中TYR-98和HIS-110 2個氨基酸殘基同樣出現了PL與3ZRC的對接模式中。

圖3 不同產地的丹參提取物對斑馬魚節間血管生長情況的影響(, n = 10)

表2 排名前10的化合物信息與結合能

Table 2 Information and binding energy of top 10 compounds

序號Pubchem CID化合物結合能/(kJ·mol?1) 16451084丹酚酸B?31.091 21794427綠原酸?28.146 310403222紫丹酸A?27.573 416730071丹參二醇A?27.179 55316800ziganein?26.447 65280445木犀草素?25.799 75280443芹菜素?25.782 864982黃芩苷?25.485 967097462-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-5-(3-hydroxypropyl)-7-methoxy-1-benzofuran-3-carbaldehyde?25.451 1051066555(2R)-2-[(E)-3-[(2S,3R)-3-[(1R)-1-carboxy-2-(3,4-dihydroxyphenyl)ethoxy]carbonyl-2-(3,4-dihydroxyphenyl)-7-hydroxy-2,3-dihydro-1-benzofuran-4-yl]prop-2-enoyl]oxy-3-(3,4-dihydroxyphenyl)propanoic acid?24.966

A-3ZRC自帶的共晶PL與活性口袋契合 B-丹酚酸B與3ZRC對接的模式圖 a-3維對接結合圖 b、c-2維對接結合圖

3.5 丹酚酸B對斑馬魚損傷血管生成的促進作用

如圖5所示，與模型組比較，10、20、40、80 μg/mL的丹酚酸B均具有顯著的促血管生成作用（＜0.01），且呈劑量相關性。

圖5 不同質量濃度的丹酚酸B對斑馬魚節間血管生長情況的影響(, n = 10)

4 討論

斑馬魚體系現已被廣泛用于藥物篩選和毒理學研究[20-21]。斑馬魚胚胎和幼魚體積很小，可用微孔培養板培養，故適合于高通量篩選[22]。斑馬魚屬于脊椎動物，是一種活體研究體系，可保留藥動學過程，故其與其他的體外研究體系相比更加適合用于中藥這種復雜化學體系的藥效學研究[23]。斑馬魚的受精卵或者魚苗能夠便利地從培養介質中吸收親水或親脂的物質，使得其檢測中藥的活性變得非常方便[24]。PTK787是一種酪氨酸激酶抑制劑，能夠特異性地抑制血管內皮生長因子受體的表達，進而抑制血管生成[25]。研究表明，瓜蔞[26]、白芍[27]、天麻[28]、丹紅注射液[29]等在斑馬魚模型上均體現了明顯的促進血管生成的作用，可逆轉PTK787誘導的血管損傷。

中藥的成分非常多，理化性質復雜，在常規的細胞學篩選體系和分子篩選體系中采用中藥進行新藥篩選時常常難以避免非特異性影響，從而產生假陽性或假陰性結果。傳統中藥具有多成分、多靶點、協同作用的特點[30-31]，建立注重整體、精準識別的藥效成分發現技術，一直是本領域的瓶頸環節。本研究借助計算化學的數據挖掘技術，建立了基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評價”的藥效成分發現方法，使計算機模擬與實驗結合，有效節約實驗時間，降低實驗成本，為天然藥效成分的高效發現提供新思路。研究表明，VHL蛋白中pVHL是HIF-1α家族的底物識別位點，靶向HIF-1α家族進行泛素介導的蛋白酶體的降解[32-34]。在正常有氧條件下，HIF-1α通過脯氨酰羥化酶（prolyl hydroxylase，PHD）家族，在脯氨酸上被羥基化引發下游信號級聯。在低氧或缺氧條件下，當PHD不能發揮功能或VHL突變時，則會改變pVHL與HIF-1α或elongin C的結合，HIF-1α不能被pVHL識別[35-37]。HIF-1α的聚集和轉錄會上調一些血管發育的重要基因（如促紅細胞生成素、VEGF），細胞增生的基因（血小板衍生因子-β、轉化生長因子-α）和糖代謝的基因（葡萄糖轉運蛋白-1）[38]。本研究發現，丹參中丹酚酸B與VHL-HIF-1α復合物具有較高的對接性能，提示丹酚酸B促進血管生成的作用可能與此作用有關，為后續的深入研究提供了方向。

綜上，本研究中成功建立了一個基于斑馬魚模型的“虛擬篩選-活性評價”的藥物篩選方法，并發現丹參中丹酚酸B是發揮促進血管生成作用的關鍵成分，為丹酚酸B應用于冠心病的防治以及新藥研發提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Crucial proangiogenic components inbased on zebrafish model and molecular docking technique

SONG Yu-qin1, 2, LU Zi-xu2, YU Jie2, DONG Meng-xuan2, GUO Shuang2, ZHUO Fang-qi2, CHEN Hao-nan2, ZHANG You-gang2, HAN Li-wen2

1. Zibo Institute for Food and Drug Control Shandong, Zibo 255086, China 2. School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, Shandong First Medical University & Shandong Academy of Medical Sciences, Jinan 250000, China

To establish a new method to explore the potential angiogenesis-promoting active components in Danshen ().Transgenic zebrafish with green fluorescent protein-labeled blood vessels was used as experimental animal, and PTK787, a vascular inhibitor, was used to establish the angiogenesis inhibition model. And this kind of experimental model was used to evaluate the angiogenesis-promoting effect ofextracts of different origins. The molecular docking technique was used to screen the potential active components offor pro-angiogenesis. The results of molecular docking screening were combined with the results of zebrafish activity assay to identify the key active ingredients.Compared with model group,extracts from different origins significantly promoted intersegmental vessels development in zebrafish (< 0.01). The lowest docking binding energy of salvianolic acid B with VHL-hypoxia inducible factor-1α complex was found by molecular docking screening, and the possible sites of action were initially revealed. The experiments using zebrafish model revealed that salvianolic acid B had a significant angiogenesis-promoting effect (< 0.01).A new method of “virtual screening-bioactivity evaluation” based on zebrafish model was established for identification of pharmacological substances in traditional Chinese medicine. Combining computational chemistry data mining technology with zebrafish activity experiments, salvianolic acid B was discovered as one of key pro-angiogenic active ingredients in. The research provides a scientific basis for the prevention and treatment of coronary heart disease and subsequent development of new drugs.

Bge.; angiogenesis; zebrafish; molecular docking; salvianolic acid B

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3394 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.015

2022-02-23

山東省自然科學基金資助項目（ZR2019MH037）；中央本級重大增減支項目（2060302-1907-09）；山東第一醫科大學學術提升計劃項目（2019LJ003）；山東省農業科技資金（園區產業提升工程）項目（2019YQ033）

宋玉琴（1978—），碩士，副主任藥師，從事中藥質量控制研究。Tel: 13953357709 E-mail: zbdasck@163.com

韓利文（1980—），博士，副研究員，從事藥物篩選及中藥質量控制研究。Tel: (0531)59567223 E-mail: hanliwen08@126.com

[責任編輯 李亞楠]