基于MAPK信號通路研究艾柱燃燒產物減輕藍光誘導ARPE-19細胞損傷的作用機制

陳如一，黃 妍，徐文靜，趙鑫鈺，夏道宗

基于MAPK信號通路研究艾柱燃燒產物減輕藍光誘導ARPE-19細胞損傷的作用機制

陳如一，黃 妍，徐文靜，趙鑫鈺，夏道宗*

浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

探討艾柱燃燒產物（moxa smoke extract，MSE）對藍光誘導人視網膜色素上皮（adult retinal pigment epithelium-19，ARPE-19）細胞損傷的保護作用及其作用機制。體外培養ARPE-19細胞，CCK-8法檢測不同質量濃度（0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、10.00、50.00、100.00、150.00 μg/mL）MSE對ARPE-19細胞活力的影響。設置對照組、對照＋MSE高劑量組、藍光組、藍光＋葉黃素組、藍光＋MSE低劑量組和藍光＋MSE高劑量組。對照組和藍光組加入空白培養基，其余4組分別加入相應的含藥培養基干預24 h后，除對照組以及對照＋MSE高劑量組外，各組均在藍光（430 nm，96.1 W/m2）下刺激1 h。建立ARPE-19細胞損傷模型后，采用乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）法檢測質膜完整性；采用倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態學變化；采用流式細胞儀檢測細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平；采用試劑盒檢測細胞內氧化應激指標丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）以及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用Western blotting法檢測絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信號通路相關蛋白表達。與對照組相比，MSE（0.25～4.00 μg/mL）對ARPE-19細胞活力沒有顯著影響。與藍光組相比，MSE可以顯著降低培養上清中的LDH活性（＜0.01），減輕質膜損傷以及細胞形態學變化，調節MAPK信號通路關鍵蛋白Ras、磷酸化c-Raf（phosphorylated c-Raf，p-c-Raf）、磷酸化細胞外調節蛋白激酶1/2（phosphorylated extracellular regulated protein kinase 1/2，p-Erk1/2）、磷酸化絲裂原活化的細胞外信號調節激酶1/2（phosphorylated mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-MEK1/2）和p-p38 MAPK表達（＜0.05、0.01），調節細胞內SOD、CAT、GSH-Px活性以及GSH、MDA、ROS水平（＜0.05、0.01），改善ARPE-19細胞氧化應激反應。MSE可能通過調控ROS介導的MAPK信號通路相關蛋白的表達，對藍光誘導的ARPE-19細胞氧化應激損傷起保護作用。

艾柱燃燒產物；ARPE-19；藍光；氧化應激；絲裂原活化蛋白激酶信號通路

視頻終端視疲勞綜合征（visual display terminal symptom，VDTS）是一種使用智能手機、平板電腦等視頻終端進行工作或學習時，出現不自覺的短暫性斜視或自覺的包括眼睛酸痛、視物模糊和眨眼頻繁等眼部癥狀的綜合征[1]。研究表明，視頻終端在使用過程中會產生大量藍光，進而誘發視網膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE）細胞產生大量活性氧（reactive oxygen species，ROS），導致蛋白質、脂質以及核酸的氧化損傷和視網膜細胞形態的改變[2-4]。近年來，由于國家對新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）流行病的防控布控，區域之間的封鎖導致人們對數字設備的使用時長急劇增加[5]，由此帶來的眼部健康問題亟待解決。本課題組前期研究表明，艾柱燃燒產物（moxa smoke extract，MSE）中的主要成分為苯酚（3.01%）、3-呋喃甲醇（2.77%）和豆甾醇（2.18%）等小分子化合物，具有較好的體外抗氧化作用[6]。然而，目前對于MSE保護成人視網膜色素上皮（adult retinal pigment epithelium-19，ARPE-19）細胞損傷的調控機制尚不明確。

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）是細胞內激酶的成員之一，能夠感受并傳導外界環境的變化，進而調節多種細胞生理過程。近來研究發現，MAPK信號通路能夠抑制由過氧化氫、白細胞介素-1β以及高濃度葡萄糖等因素誘導的RPE細胞損傷，通過抑制p38 MAPK的表達對RPE細胞產生保護作用[7-9]。本研究通過制備藍光誘導ARPE-19細胞損傷模型，以MAPK信號通路調控ROS生成，抑制ARPE-19細胞氧化應激損傷為切入點，探討MSE是否可通過調控ARPE-19細胞內的氧化還原平衡，減少氧化應激損傷，從而發揮對ARPE-19細胞的保護作用。

1 材料

1.1 細胞

ARPE-19細胞購自廣州吉妮歐生物科技有限公司。

1.2 藥物

艾柱（批號20190415）購自浙江乾一生物科技有限公司；葉黃素（批號F10J10M92153）購自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 試劑

CCK-8試劑盒（批號71011500）購自白鯊生物科技有限公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，批號分別為20201119、20200815、20200819、20200820、20200822、20200820；ROS檢測試劑盒（批號061521210723）購自碧云天生物技術有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號030321210621）購自上海碧云天生物技術有限公司；Ras抗體、c-Raf抗體、磷酸化c-Raf（phosphorylated c-Raf，p-c-Raf）抗體、細胞外調節蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，Erk1/2）抗體、磷酸化Erk1/2（phosphorylated Erk1/2，p-Erk1/2）抗體、絲裂原活化的細胞外信號調節激酶1/2（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2，MEK1/2）抗體、磷酸化MEK1/2（phosphorylated MEK1/2，p-MEK1/2）抗體、p38 MAPK抗體、磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體購自美國CST公司，批號分別為5、1、10、28、24、2、18、9、13、8；熒光標記的山羊抗兔IgG抗體（批號C70428-05）、熒光標記的山羊抗小鼠IgG抗體（批號C70124-05）購自美國LI-COR公司。

1.4 儀器

RE52CS-1型旋轉蒸發器（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ型循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；W201B型數控恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術有限公司）；BSA224S-CW型電子天平（德國Sartorius公司）；超凈臺、CO2培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；5427R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；PL-LED100F型光源（北京普林塞斯科技有限公司）；數字式照度計（深圳聚茂源科技有限公司）；Synergy H1MFD型多功能酶標儀（美國BioTek公司）；Mini-PROTEAN Tetra System垂直電泳槽、PowerPacTM HC型高電流電源（美國Bio-Rad公司）；Odyssey CLx型雙色紅外激光成像系統（美國LI-COR公司）；ECLIPSE Ti-S型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；CytoFLEX流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 方法

2.1 MSE的制備

稱取200 g艾柱于自制燃燒裝置中暗火燃燒，在吸收瓶中加入適量無水乙醇作為煙霧吸收溶劑，緩沖瓶與真空泵連接。通過調節循環水泵控制艾柱的燃燒速度，使艾煙能夠被充分吸收。將飽和的艾煙吸收溶劑過濾，減壓蒸餾直到無餾分餾出，得到MSE[6]。稱定質量，用無水乙醇稀釋到35 mg/mL備用。

2.2 ARPE-19細胞培養和處理

ARPE-19細胞以含10%胎牛血清和100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至70%～80%時用胰酶消化收集細胞，調整細胞密度為2×105個/mL，鋪板/皿適應12 h后，按照以下分組處理：對照組和藍光組更換新鮮培養基培養；對照＋MSE高劑量組和藍光＋MSE高劑量組，換用含2 μg/mL MSE的培養基培養；藍光＋MSE低劑量組，換用含1 μg/mL MSE的培養基培養；藍光＋葉黃素組換用含30 μmol/L葉黃素[10]的培養基培養。藥物預保護24 h后，根據Park等[11]方法稍作修改建立藍光誘導ARPE-19細胞損傷模型：從CO2培養箱中取出細胞恢復室溫，加入適量PBS補充光照導致的水分蒸發。在室溫下將對照和對照＋MSE高劑量組置于桌面避光放置，其余分組均置于桌面用LED藍光源（430 nm，96.1 W/m2）從正上方均勻光照1 h，即得藍光誘導ARPE-19細胞損傷模型。

2.3 CCK8檢測細胞存活率

取處于對數生長期的ARPE-19細胞，調整細胞密度為5×104個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板中，置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養12 h。設置空白組、對照組和給藥組（分別加入MSE至終質量濃度為0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、5.00、10.00、50.00、100.00、150.00 μg/mL），孵育24 h后小心吸走培養液，加入預混的CCK8工作液（每100 μL新鮮基礎培養液＋10 μL CCK8），37 ℃避光孵育45 min，采用多功能酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率，以對細胞無毒性的質量濃度作為后續實驗用濃度范圍。

細胞存活率＝(MSE－空白)/(對照－空白)

2.4 LDH活性的測定

取處于對數生長期的ARPE-19細胞，接種于96孔板中，按照“2.2”項下方法進行分組及處理后，收集上清液，按試劑盒說明書檢測細胞上清液中LDH活性。

2.5 MSE對藍光誘導的ARPE-19細胞形態的影響

取處于對數生長期的ARPE-19細胞，接種于6 cm細胞培養皿中，按照“2.2”項下方法進行分組及處理后，小心吸走培養液，用PBS緩沖液清洗1遍，加入2 mL PBS緩沖液后，于倒置熒光顯微鏡下觀察各組細胞狀態，并拍照記錄。

2.6 流式細胞術和倒置熒光顯微鏡觀察ARPE-19細胞ROS水平

取處于對數生長期的ARPE-19細胞，接種于6 cm細胞培養皿中，按照“2.2”項下方法進行分組及處理后，小心吸走培養液，用PBS緩沖液清洗1遍，每孔加入1 mL用RPMI 1640培養基稀釋的終濃度為20 μmol/L的DCFH-DA熒光染色液，于37 ℃、5% CO2培養箱培養60 min，小心吸走DCFH-DA熒光染色液，用PBS緩沖液清洗3遍，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA熒光探針，于倒置熒光顯微鏡下觀察各組ARPE-19細胞中ROS表達情況，并拍照記錄。隨后，收集ARPE-19細胞，加入0.4 mL PBS緩沖液混勻。冰浴避光，30 min內在流式細胞儀上檢測細胞中ROS水平。

2.7 ARPE-19細胞中MDA、GSH水平及GSH-Px、CAT、SOD活性檢測

取處于對數生長期的ARPE-19細胞，接種于10 cm細胞培養皿中，按照“2.2”項下方法進行分組及處理后，收集細胞。ARPE-19細胞冰上勻漿后用于后續分析抗氧化參數。采用BCA法對各組細胞勻漿進行蛋白定量。隨后，按照試劑盒說明書操作，SOD活性使用WST-1法檢測，CAT、GSH-Px活性使用可見光法測定，GSH水平使用微量酶標法檢測，MDA水平測定使用硫代巴比妥酸法。

2.8 Western blotting檢測MAPK信號通路相關蛋白的表達

取處于對數生長期的ARPE-19細胞，接種于10 cm細胞培養皿中，按照“2.2”項下方法進行分組及處理后，收集細胞。細胞裂解后提取總蛋白，采用BCA法進行蛋白定量，加入適量上樣緩沖液后，100 ℃恒溫金屬浴變性10 min，得到蛋白樣品。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，于5%脫脂牛奶中室溫封閉1 h，分別加入Ras、c-Raf、p-c-Raf、Erk1/2、p-Erk1/2、MEK1/2、p-MEK1/2、p38和p-p38抗體（1∶1000），4 ℃冰箱內搖床上孵育過夜，以GAPDH（1∶5000）作為內參，3次TBST緩沖液洗膜后，加入熒光標記的二抗（1∶10 000），室溫避光孵育2 h；3次TBST洗膜后，用Odyssey CLx 雙色紅外激光成像系統顯影成像，用Image J軟件分析條帶灰度值。

2.9 統計學分析

所有數據均采用Graphpad Prism 8.0軟件進行統計學處理并作圖表示，統計變量以表示，多組間比較采用單因素方差分析。

3 結果

3.1 MSE對ARPE-19細胞存活率的影響

不同質量濃度的MSE處理ARPE-19細胞24 h，如圖1所示，0.25～4.00 μg/mL質量濃度的MSE對細胞活力沒有顯著影響，說明MSE在0.25～4.00 μg/mL對ARPE-19細胞無細胞毒性；當MSE質量濃度超過4.00 μg/mL時，細胞活力明顯下降（＜0.05、0.01），說明超過4.00 μg/mL的質量濃度不宜作為實驗濃度，為了保持細胞處于最佳的活力，因此在后續實驗中MSE低、高劑量組分別設置為1、2 μg/mL。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01

3.2 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞損傷的影響

在藍光（430 nm，96.1 W/m2）下光照ARPE-19細胞1 h，如圖2所示，高劑量的MSE對于對照組細胞并無顯著影響；而藍光組細胞上清液中LDH活性顯著升高（＜0.01）；給予30 μmol/L葉黃素之后LDH活性顯著下降（＜0.01）；給予MSE后，上清液中的LDH活性顯著下降（＜0.01），且呈劑量相關性。表明藍光誘導的ARPE-19細胞損傷模型成功成立，MSE對藍光誘導的ARPE-19細胞損傷有顯著的保護作用，且呈劑量相關性。

3.3 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞形態學的影響

如圖3所示，對照組ARPE-19細胞之間具有明顯的網狀連接；與對照組相比，對照＋MSE高劑量組無顯著變化，網狀連接明顯；而藍光組中ARPE-19細胞間網狀連接明顯消失，細胞間距增大，呈分散趨勢，由此說明藍光照射對于ARPE-19細胞造成了損傷。與藍光組相比，隨著給予葉黃素以及MSE濃度的增大，細胞間的網狀連接得到保護，藍光＋MSE高劑量組基本接近對照組。表明MSE能夠顯著改善藍光誘導下受損的ARPE-19細胞形態。

A-對照組 B-對照＋MSE高劑量組 C-藍光組 D-藍光＋葉黃素組 E-藍光＋MSE低劑量組 F-藍光＋MSE高劑量組 與對照組比較：##P＜0.01；與藍光組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

圖3 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞形態的影響 (×200)

3.4 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞ROS水平的影響

采用流式細胞儀，以DCFH-DA作為熒光探針對ARPE-19細胞內ROS水平進行檢測，如圖4所示，對照＋MSE高劑量組的ROS熒光水平較對照組顯著降低（＜0.01），說明MSE不僅針對受損細胞，對正常ARPE-19細胞亦具有一定的保護作用；而藍光組較對照組ROS水平顯著上升（＜0.01），且隨著MSE濃度的增加，細胞內ROS熒光水平顯著降低（＜0.01）；在給予葉黃素預保護24 h后，ARPE-19細胞中ROS熒光水平顯著降低（＜0.01）。倒置熒光顯微鏡下的結果（圖5）與上述結果一致。

圖4 流式細胞術檢測MSE對藍光誘導ARPE-19細胞中ROS水平的影響(, n = 3)

圖5 倒置熒光顯微鏡法檢測MSE對藍光誘導ARPE-19細胞ROS水平的影響(×200)

3.5 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞MDA、GSH水平及GSH-Px、CAT、SOD活性的影響

如圖6所示，與對照組相比，對照＋MSE高劑量組MDA、GSH水平及GSH-Px、CAT、SOD活性未見明顯改變；藍光組細胞內MDA水平顯著升高（＜0.01），GSH水平和GSH-Px、CAT、SOD抗氧化酶活性顯著下降（＜0.01）；與藍光組相比，MSE組細胞內GSH水平和SOD、CAT、GSH-Px活性均顯著升高（＜0.05、0.01），MDA水平顯著降低（＜0.01），呈劑量相關性；給予葉黃素后，各項指標均有所改善。

3.6 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞中MAPK通路相關蛋白表達的影響

如圖7所示，與對照組相比，對照＋MSE高劑量組細胞MAPK通路相關蛋白表達并無顯著差異；而經藍光誘導后的ARPE-19細胞中的Ras、p-Raf、p-MEK1/2、p-Erk1/2、p-p38蛋白表達水平均顯著升高（＜0.01）；葉黃素能顯著降低細胞Ras、p-Raf、p-MEK1/2、p-Erk1/2、p-p38蛋白表達水平（＜0.01）；MSE組細胞上述蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），并呈劑量相關性。

圖6 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞中MDA、GSH水平及CAT、GSH-Px、SOD活性的影響(, n = 3)

圖7 MSE對藍光誘導ARPE-19細胞MAPK信號通路相關蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

本課題組前期研究已經在體外驗證了MSE較艾柱揮發油具有更好的抗氧化性能。為了闡明MSE保護藍光誘導ARPE-19細胞損傷作用的具體機制，從其對抑制ARPE-19細胞內氧化應激反應以及MAPK信號通路相關蛋白表達2方面的影響進行探索。1985年，“氧化應激”作為氧化還原生物學和醫學中的1個概念被正式提出，其有2部分組成：有氧代謝以氧化還原平衡穩態的形式存在以及用專業的術語表達了這種平衡之間潛在的張力，即生物體的應激反應[12]。視網膜是人體中耗氧量最高的組織之一[13]。高強度的有氧代謝以及持續的光照都會誘導視網膜中產生過量的ROS[14-15]。研究證明，400～500 nm波長的藍光可誘導RPE細胞產生過量的ROS[16]，過量的ROS與細胞內脂質反應產生MDA，進而破壞細胞膜完整性及流動性，引起細胞膜損傷[17]。同時，過量的ROS會導致線粒體功能的破壞，此過程往往伴隨著細胞內酶（包括LDH）的大量釋放，而與其他所有酶相比，LDH在這一過程中增加地更多[18]。因此，本研究通過檢測LDH活性證明了藍光暴露能夠誘導ARPE-19細胞損傷模型。通過對藍光照射前后ARPE-19細胞形態學的觀察，進一步確認了藍光照射對ARPE-19細胞造成了損傷，使細胞間的網狀連接消失，細胞間距增大。研究證明，機體內部的抗氧化防御的主要作用是由抗氧化酶實現的，而不是小分子的抗氧化物[12]。如在GSH-Px的催化下，GSH向ROS提供1個質子以穩定氧自由基，并轉換為氧化型谷胱甘肽（glutathione disulfide，GSSG）[19]。

葉黃素是一種在人類腦組織中占主導地位的類胡蘿卜素[20-21]，能夠自由地穿過血視網膜屏障[22]，并通過過濾高能短波的光線來減弱視網膜處的光化學損傷。葉黃素通過清除過量的ROS、超氧化物和羥基自由基，避免視網膜磷脂的過氧化，減少脂褐素的形成，進而減輕光誘導的相關損傷[23]。以葉黃素為陽性對照藥物，本研究發現MSE能夠有效降低ARPE-19細胞中ROS和MDA水平，提高GSH水平；顯著提高細胞內抗氧化酶GSH-Px、CAT和SOD活性，MSE高劑量組在部分實驗指標上甚至優于陽性對照藥物。由此推測MSE保護ARPE-19細胞免受藍光損傷的機制可能在于其中含有某種脂溶性成分能夠滲透血視網膜屏障，進而恢復細胞內的氧化還原穩態，提高細胞活力。

另一方面，由于方法學的重大進展，將這種生物體內的氧化還原轉換同磷酸化與去磷酸化信號聯系起來的重要性得到了充分的認識[12]。MAPK級聯反應信號通路是最關鍵的細胞內信號途徑之一[24-25]。環境應激會引起MAPK信號通路相關蛋白活性的改變[26]，其激活狀態依賴相關蛋白激酶與其磷酸化蛋白的共同調節，這種調節是可逆的，機體會根據體內環境的變化而進行動態調整，使其處于一種動態平衡的狀態[27]。Ras和Raf是最早被報道的癌蛋白[28-29]，Ras的激活會將Raf或Raf/MEK異二聚體募集到質膜，隨后Raf和MEK組裝瞬時四聚體，通過背對背二聚化促進Raf的激活[30]。Raf一旦被激活，就會對217和221位MEK1/2上絲氨酸殘基進行磷酸化，進一步導致Erk1/2的磷酸化[31]。本研究結果顯示，藍光組Ras、p-c-Raf/c-Raf、p-MEK1/2/MEK1/2、p-ERK1/2/ERK1/2及p-p38/p38均顯著高于對照組，說明氧化應激導致了Ras、Raf、MEK1/2、Erk1/2、p38信號通路的級聯反應，這與以往的研究結果一致[32-33]。研究表明，UV誘導的Erk1/2-MAPK的激活是通過ROS的生成介導的[34]，ROS在激活Erk1/2-MAPK信號通路中起核心作用[35]。而MSE在有效降低藍光誘導的ARPE-19細胞中ROS含量的同時，顯著降低了Ras蛋白以及Raf、MEK1/2、Erk1/2、p38磷酸化蛋白的表達。這說明MSE可能是通過抑制ROS介導的氧化應激反應來保護藍光誘導的ARPE-19細胞損傷。

綜上，MSE對藍光誘導的ARPE-19細胞損傷具有顯著的保護作用，其機制可能與改善細胞內氧化還原穩態，抑制MAPK信號通路有關，然而藍光誘導的ARPE-19細胞損傷是否經由鐵死亡途徑誘發，MSE能否在調節MAPK信號通路的基礎上進一步通過核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/胱氨酸/谷氨酸逆向轉運蛋白溶質載體家族7成員11（solute carrier family 7 member 11，SLC7A11，也稱為xCT）信號通路減輕ARPE-19細胞鐵死亡有待進一步研究。本課題組將在今后繼續圍繞Nrf2/xCT信號通路結合分子對接技術對MSE中的藥效物質成分展開研究，深入探討MSE基于調控Nrf2/xCT信號通路保護ARPE-19防治視疲勞的作用機制。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of moxa smoke extract on attenuating blue light induced ARPE-19 cell injury based on MAPK signaling pathway

CHEN Ru-yi, HUANG Yan, XU Wen-jing, ZHAO Xin-yu, XIA Dao-zong

School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China

To investigate the effect and mechanism of moxa smoke extract (MSE) on blue light-induced ARPE-19 cells injury.ARPE-19 cells were cultured, and effect of MSE at different concentrations (0.25, 0.50, 1.00, 2.00, 4.00, 5.00, 10.00, 50.00, 100.00, 150.00 μg/mL) on viability of ARPE-19 cells was detected by CCK-8 method. Control group, control + MSE high-dose group, blue-light group, blue-light + lutein group, blue-light + MSE low-dose group and blue-light + MSE high-dose group were set. Blank medium was added to control group and blue light group, and corresponding drug-containing medium was added to the other four groups, after intervention for 24 h, except for control group and control + MSE high-dose group, all groups were stimulated under blue light (430 nm, 96.1 W/m2) for 1 h. After ARPE-19 cell injury model was established, integrity of plasma membrane was detected by lactate dehydrogenase (LDH) method; Morphological changes of cells were observed by inverted fluorescence microscope; Intracellular reactive oxygen species (ROS) level were detected by flow cytometry species; Kits were used to detect intracellular oxidative stress indicators malondialdehyde (MDA), glutathione (GSH) levels and glutathione peroxidase (GSH-Px), catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities; Western blotting was used to detect mitogen-activated protein kinases (MAPK) signaling pathway-related proteins expressions.Compared with control group, MSE (0.25—4.00 μg/mL) had no significant effect on viability of ARPE-19 cells. Compared with blue light group, MSE significantly reduced LDH activity in culture supernatant (< 0.01), alleviated the damage of plasma membrane and cell morphological changes, regulated key proteins expressions of MAPK signaling pathway such as Ras, phosphorylated c-Raf (p-c-Raf), phosphorylated extracellular regulated protein kinase 1/2 (p-Erk1/2), phosphorylated mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase 1/2 (p-MEK1/2) and p-p38 MAPK (< 0.05, 0.01), regulated intracellular SOD, CAT, GSH-Px activities and GSH, MDA, ROS levels (< 0.05, 0.01), and improved the oxidative stress response of ARPE-19 cells.MSE may protect ARPE-19 cells from blue light-induced oxidative stress injury by regulating the expression of ROS-mediated MAPK signaling pathway-related proteins.

moxa smoke extract; ARPE-19 cells; blue light; oxidative stress; mitogen-activated protein kinases signaling pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2022)11 - 3376 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.013

2022-02-09

國家自然科學基金資助項目（82074085）；浙江省自然科學基金資助項目（LY21H280006）

陳如一（1996—），男，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學。Tel: 15700068486 E-mail: 498996135@qq.com

夏道宗，博士生導師，教授，主要從事中藥藥理學研究。Tel: (0571)86633361 E-mail: xiadaozong@zcmu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]