基于UPLC-Q-TOF-MS的人參配方顆粒化學成分及指紋圖譜研究

王 靜，姚長良，張建青，李佳媛，姚 帥，果德安*

基于UPLC-Q-TOF-MS的人參配方顆粒化學成分及指紋圖譜研究

王 靜1, 2，姚長良2，張建青2，李佳媛2，姚 帥2，果德安1, 2*

1. 廣東藥科大學中藥學院，廣東 廣州 510006 2. 中國科學院上海藥物研究所 中藥標準化技術國家工程研究中心，上海 201203

采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜聯用技術（UPLC-Q-TOF-MS）對人參配方顆粒標準湯劑化學成分進行快速表征，闡明人參配方顆粒的化學物質基礎，并建立指紋圖譜方法對人參配方顆粒進行質量控制。采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），以乙腈-0.1%甲酸水溶液為流動相進行梯度洗脫，在正、負離子模式下分別采集人參配方顆粒標準湯劑的質譜數據，通過MS DIAL軟件輔助解析、數據庫檢索和對照品比對等方法快速分析人參配方顆粒標準湯劑化學成分。并采用ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），乙腈-0.01%磷酸水溶液為流動相，建立人參配方顆粒指紋圖譜方法。從人參配方顆粒標準湯劑中共鑒定出57個化合物，包括皂苷25個、氨基酸及其衍生物12個、堿基及核苷5個、其他類成分15個。建立的人參配方顆粒指紋圖譜有8個共有峰，分別為人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rc、Ro、Rb1、Rb2、Rd。指紋圖譜方法精密度、穩定性、重復性良好，不同廠家不同批次人參配方顆粒的成分基本相同，僅含量上存在一定差異。該研究基本闡明了人參配方顆粒的化學物質基礎，建立的指紋圖譜方法為人參配方顆粒的質量控制提供了方法參考。

人參配方顆粒；指紋圖譜；UPLC-Q-TOF-MS；高效液相色譜；人參皂苷；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rf；人參皂苷Rc

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經水提、濃縮、干燥、制粒而成，具有便攜、易于貯存和使用等特點，是對傳統中藥飲片的補充[1-3]。雖然中藥配方顆粒已經獲得廣泛的應用，但其化學物質基礎及質量控制研究仍然滯后。人參為五加科人參屬植物C. A. Mey.的干燥根及根莖[4]。由于其具有大補元氣、除邪明目和益智安神等功效，是常用的補益要藥[5-6]。目前，對于人參藥材化學物質基礎已有深入研究，主要含有皂苷、糖、揮發性成分、脂、蛋白質及甾醇類等成分[7-11]，其中皂苷類成分研究最多，Zuo等[12]從人參中鑒定了286個人參皂苷。人參配方顆粒應用廣泛，其由人參經水提制得，化學物質基礎與人參藥材存在明顯差異。但目前人參配方顆粒的物質基礎研究鮮有報道，因此也阻礙了科學可行的人參配方顆粒質量控制方法的構建。本研究采用UPLC-Q-TOF/MS技術，通過數據庫檢索、對照品比對和MS DIAL軟件輔助解析等方法快速分析人參配方顆粒標準湯劑化學成分，并建立人參配方顆粒的指紋圖譜方法，從而達到控制人參配方顆粒質量的目的。

1 儀器與材料

Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀、Waters Xevo G2-S Q-TOF質譜儀（Waters公司，美國）；P180H型超聲波水浴鍋（德國埃爾瑪公司）；Quintix 224-1 CN-1型電子天平（賽多利斯北京有限公司）；Agilent 1290型超高效液相色譜儀，配置Agilent G7111B四元泵、Agilent G7129A進樣器、Agilent G7115A DAD檢測器；Milli-Q Integral超純水系統（Millipore公司，Bedford，美國）。

色譜純乙腈（批號UCNA1H，Honeywell），分析純甲醇（批號20210208，國藥集團上海化學試劑有限公司），質譜級甲酸（批號UUQBH-JX，梯希愛上海化成工業發展有限公司），色譜級磷酸（批號20200731，色譜級，Tedia公司）。

對照品人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，批號3852，質量分數98.0%）、人參皂苷Re（ginsenoside Re，批號4147，質量分數98.0%）、人參皂苷Rf（ginsenoside Rf，批號3071，質量分數98.0%）、人參皂苷Rc（ginsenoside Rc，批號7879，質量分數98.0%）、人參皂苷Ro（ginsenoside Ro，批號8689，質量分數98.0%）、人參皂苷Rd（ginsenoside Rd，批號8262，質量分數98.0%）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，批號2326，質量分數98.0%）、人參皂苷Rb2（ginsenoside Rb2，批號9039，質量分數98.0%）均購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。

18批人參配方顆粒來源信息見表1。人參藥材購自上海雷允上藥業有限公司，經上海藥物研究所中藥現代化中心姚帥高級實驗師鑒定為五加科人參屬植物人參C. A. Mey.，符合《中國藥典》2020版一部人參項的有關規定。

表1 18批人參配方顆粒來源

Table 1 Sources of 18 batches of Ginseng Dispensing Granules

編號批號廠家 S1211201001上海萬仕誠藥業有限公司 S2211201002上海萬仕誠藥業有限公司 S3211201003上海萬仕誠藥業有限公司 S41071251廣東一方制藥有限公司 S5A1120551廣東一方制藥有限公司 S6A1120541廣東一方制藥有限公司 S7A1120561廣東一方制藥有限公司 S8A1129571廣東一方制藥有限公司 S9A1105171廣東一方制藥有限公司 S10A1129582廣東一方制藥有限公司 S112006001C華潤三九醫藥股份有限公司 S122103002C華潤三九醫藥股份有限公司 S132005003C華潤三九醫藥股份有限公司 S142005001C華潤三九醫藥股份有限公司 S152005002C華潤三九醫藥股份有限公司 S1621056494江陰天江藥業有限公司 S1721100641江陰天江藥業有限公司 S1821060091江陰天江藥業有限公司

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rc、Ro、Rb1、Rb2、Rd對照品適量，分別加50%甲醇水制成100 μg/mL的對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

2.2.1 人參配方顆粒供試品的制備 取人參配方顆粒適量，研細，稱取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇水20 mL，超聲處理30 min，14 000 r/min離心，取上清液，即得。

2.2.2 人參配方顆粒標準湯劑及其供試品的制備 標準湯劑（實驗室自制）：取人參藥材粉末100 g，加10倍量水浸泡30 min，武火加熱沸騰后保持微沸煎煮60 min，經150目濾布濾過，藥渣加8倍量水，保持微沸煎煮30 min，合并濾液，濃縮，凍干，得人參配方顆粒標準湯劑粉末[3,13]；精密稱取1 g粉末，加50%甲醇水20 mL，超聲處理30 min，14 000 r/min離心，取上清液，即得。

2.3 色譜、質譜條件

2.3.1 人參配方顆粒標準湯劑的成分分析 色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～1 min，2% A；1～16 min，2%～30% A；16～25 min，30%～44% A；25～28 min，44%～95% A；28～29 min，95%～100% A；29～32 min，100% A），柱溫為30 ℃；進樣體積為2 μL；體積流量為0.3 mL/min。

質譜條件：電噴霧離子源采用正、負離子模式進行數據采集，以氮氣為霧化氣和錐孔氣，采集方法為fast DDA。正離子模式參數：毛細管電壓為2.5 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為120 ℃，去溶劑氣溫度450 ℃，錐孔氣體積流量30 L/h，去溶劑氣體積流量600 L/h。負離子模式參數：毛細管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120 ℃；去溶劑氣溫度450 ℃，錐孔氣體積流量50 L/h，去溶劑氣體積流量800 L/h。掃描范圍/100～1500，采集時間0.1 s，當基峰離子強度高于10 000時，觸發前三強母離子的二級掃描。碰撞能低質量端設置為10～30 V，高質量端設置為30～50 V。

2.3.2 人參配方顆粒指紋圖譜 色譜條件：ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm），流動相為0.01%磷酸水溶液（A）和乙腈（B），梯度洗脫（0～20 min，20%～24% B；20～33 min，24%～28% B；33～60 min，28%～36% B），柱溫為35 ℃，進樣體積為2 μL，檢測波長為203 nm；體積流量為0.3 mL/min。

2.4 數據處理

首先，將采集的高分辨質譜數據通過MSconvert軟件進行數據格式轉換，后將轉換格式后的數據導入MS DIAL軟件中進行解卷積、峰提取、代謝物鑒定。并結合高分辨質譜數據提供的準分子離子及二級碎片信息，使用Masslynx軟件進行數據分析。

3 結果

3.1 人參配方顆粒標準湯劑的物質基礎研究

采用UPLC-QTOF-MS技術獲得人參配方顆粒標準湯劑的高分辨質譜數據，其在正、負離子模式下的基峰離子流圖見圖1。通過數據解析共鑒定57個化合物，包括皂苷25個、氨基酸及其衍生物12個、堿基及核苷5個、其他類成分15個，鑒定結果見表2。

A-正離子模式 B-負離子模式

表2 人參配方顆粒標準湯劑成分鑒定

Table 2 Composition identification of Ginseng Dispensing Granules standard decoction

序號tR/min質量數（m/z）分子式加和離子誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱參考文獻 10.79175.120 5C6H14N4O2M＋H1.0175.120 5, 158.093 0, 130.097 5, 116.071 7, 70.067 2精氨酸14-15 20.80337.171 8C12H24N4O7M＋H?0.5337.171 8, 175.120 9, 158.093 2精氨酸葡萄糖苷16 30.83499.225 0C18H34N4O12M＋H?0.1499.225 0, 337.169 2, 175.120 7, 158.093 6精氨酸葡萄二糖苷16 40.86195.047 7C6H12O7M－H?2.8195.049 6, 177.036 7, 147.026 8, 129.013 1, 99.001 5, 74.998 9, 59.003 2葡萄糖酸17 50.86209.028 0C6H10O8M－H?1.7209.027 7, 191.017 4, 133.010 0, 129.015 4, 85.020 8, 71.004 4, 57.023 3葡萄糖二酸18 60.95191.057 7C7H12O6M－H2.1191.057 7, 127.039 1, 85.030 2奎寧酸19-20 70.96341.106 9C12H22O11M－H?1.5341.107 3, 179.053 0, 119.028 9, 89.016 3, 71.000 40, 59.003 4蔗糖19 80.98503.160 3C18H32O16M－H?0.9503.158 7, 341.102 2, 221.063 9, 179.052 3, 119.027 6, 89.016 3棉子糖17,20 91.03133.009 6C4H6O5M－H?4.1133.009 3, 115.004 3, 71.014 6蘋果酸14,20 100.92116.069 5C5H9NO2M＋H?1.7116.070 8, 70.064 6脯氨酸18,21 111.19266.122 6C10H19NO7M＋H?1.4248.113 6, 230.103 6, 194.085 5, 98.058 6γ-氨基丁酸葡萄糖苷17 121.37136.064 0C5H5N5M＋H1.7136.062 5, 119.035 1腺嘌呤19-20 131.49123.057 3C6H6N2OM＋H1.5123.057 4, 96.044 2, 80.050 2煙酰胺18,22 141.62191.018 1C6H8O7M－H?1.1191.015 7, 173.008 5, 129.016 4, 111.002 0, 87.000 3, 57.022 0檸檬酸18,20 15a1.62274.092 0C11H15NO7M＋H?0.7238.070 7, 192.066 7, 130.049 3, 97.029 7脯氨酸戊糖苷 161.71130.050 9C5H7NO3M＋H0.5130.049 6, 84.046 7L-焦谷氨酸15,19 172.11182.081 7C9H11NO3M＋H0.0165.057 5, 136.078 3, 123.046 7酪氨酸15,21 182.17113.035 7C4H4N2O2M＋H0.6113.036 2, 96.007 3, 70.065 6尿嘧啶19-20 192.30132.102 1C6H13NO2M＋H?0.486.097 9亮氨酸15,21 20a2.55294.155 9C12H23NO7M＋H0.6276.147 2, 230.138 0, 144.102 3, 86.101 7異亮氨酸果糖苷 212.90268.104 8C10H13N5O4M＋H0.2268.105 4, 136.063 5腺苷16,22 22a3.15252.109 2C10H13N5O3M＋H?0.5252.109 2, 136.063 5蟲草素 233.22284.099 1C10H13N5O5M＋H?0.4225.127 6, 152.058 9, 135.031 4, 110.035 4鳥苷20-21 243.99166.086 8C9H11NO2M＋H0.0120.083 4, 103.057 6苯丙氨酸14,15 255.31382.098 9C14H17N5O8M－H?1.0266.087 8, 206.068 5, 115.006 5琥珀酰腺苷17 265.32127.041 2C6H6O3M＋H1.7127.039 9, 109.034 6麥芽酚17 276.14205.098 2C11H12N2O2M＋H0.5188.071 2, 159.094 0, 118.065 0色氨酸14-15 289.39337.092 7C16H18O8M－H0.4191.056 3, 173.044 293.352香豆酰奎寧酸22 2910.67163.041 1C9H8O3M－H1.6163.036 7, 119.050 7對香豆酸17,20 30c14.051 007.540 0C48H82O19M＋HCOO?3.1961.534 7, 799.479 7, 637.433 1PPT-3Glc 31s14.40977.529 4C47H80O18M＋HCOO?2.7931.524 9, 799.484 1, 637.430 6三七皂苷R1 32s15.07845.489 3C42H72O14M＋HCOO?0.6845.489 3, 799.486 6, 637.434 5, 475.381 5人參皂苷Rg1 33s15.12991.549 4C48H82O18M＋HCOO1.6945.541 5, 783.490 1, 637.430 3, 475.380 8, 119.028 4人參皂苷Re 3415.89885.482 2C45H74O17M－H?2.6841.494 6, 781.471 9, 619.421 0, 475.381 0丙二酰人參皂苷Rg119,23 3516.371 031.542 7C51H84O21M－H1.6987.550 2, 945.539 6, 927.529 4, 637.428 7丙二酰人參皂苷Re19,23 36s18.80845.489 3C42H72O14M＋HCOO?0.6799.481 5, 637.431 0, 475.380 2人參皂苷Rf 3719.47815.478 6C41H70O13M＋HCOO?0.7769.470 6, 637.431 0, 475.377 2, 161.042 3三七皂苷R219,23 38s20.14829.492 4C42H72O13M＋HCOO?2.5783.487 5, 637.429 9, 475.378 0, 161.041 4人參皂苷Rg2 39s20.241 153.603 0C54H92O23M＋HCOO2.41 107.588 6, 945.537 9, 783.486 3, 179.051 9人參皂苷Rb1

續表1

序號tR/min質量數（m/z）分子式加和離子誤差(×10?6)碎片離子化合物名稱參考文獻 40a20.40329.232 3C18H34O5M－H?0.5329.231 9, 229.142 0, 211.133 7, 171.099 9, 139.107 8,99.072 29,10,13-TriHOME 4120.531 193.598C50H98O31M－H?3.71 149.602 9, 1 107.588 0, 945.542 2丙二酰人參皂苷 Rb119,23 42s20.801 123.594 0C53H90O22M＋HCOO4.01 077.583 5, 783.493 3, 621.433 1人參皂苷Rc 43s20.94955.487 1C48H76O19M－H?3.2955.487 5, 793.431 8, 569.382 1, 455.351 5人參皂苷Ro 4421.161 163.586 5C49H96O30M－H?4.51 119.592 7, 1 077.580 2, 1 059.568 6, 945.542 5,765.487 1丙二酰人參皂苷Rc19,23 45s21.321 123.587 0C53H90O22M＋HCOO?3.01 077.580 8, 783.480 7, 621.435 7人參皂苷Rb2 46s21.491 123.587 0C53H90O22M＋HCOO?3.01 077.580 1, 783.481 0, 621.434 3人參皂苷Rb3 4721.641 163.586 0C49H96O30M－H?4.51 119.592 7, 1 077.580 2, 1 059.568 6丙二酰人參皂苷Rb219,23 4821.801 163.586 3C49H96O30M－H?4.51 119.592 7, 1 077.580 2, 1 059.568 6丙二酰人參皂苷Rb319,23 49s22.55991.549 4C48H82O18M＋HCOO1.6945.544 1, 783.488 3, 621.433 3, 161.041 3人參皂苷 Rd 50c22.64793.435 9C42H66O14M－H?1.5793.437 8, 631.383 2OA-Glc-GlurA 5122.901 031.543 3C51H84O21M－H1.6987.550 2, 945.539 6, 927.529 4, 637.428 7丙二酰人參皂苷Rd19,23 52c26.59793.435 9C42H66O14M－H?1.5793.436 5, 731.439 7, 631.390 4, 569.382 7, 455.351 5OA-Glc-GlurA 5326.74261.184 5C17H24O2M＋H?1.0261.184 3, 105.034 4人參環氧炔醇24 54s26.96829.496 3C42H72O13M＋HCOO1.4783.489 1, 621.434 3, 459.380 0, 161.041 4人參皂苷Rg3 55c27.50631.382 9C36H56O9M－H?1.7631.382 4, 555.364 1, 455.347 5OA-Glur A 5628.00811.479 6C42H70O12M＋HCOO?4.8765.477 7, 603.429 7, 161.042 3人參皂苷Rg512,25 5728.25279.232 0C18H30O2M＋H?0.4201.052 1, 95.085 3, 81.068 8亞麻酸19

s-用對照品比對 a-與MS DIAL數據庫中二級質譜圖進行比較鑒定 c-根據裂解規律進行推斷

s-refers to compounds identified by comparing with reference standard a-refers to compounds identified by comparing with MS/MS data obtained from MS DIAL c-refers to compouds characterized according to fragmentation rules

3.1.1 皂苷類 皂苷類成分是人參的主要藥效成分之一，是由苷元和1個或幾個糖組成，人參中人參皂苷大部分為原人參三醇（PPT）和原人參二醇（PPD）型，含有少量的齊墩果酸（OA）型皂苷[12,25]。通常在負離子模式下具有較好的響應，形成豐富的[M－H]?或[M＋HCOO]?離子，母離子中的糖苷鍵斷裂產生一系列脫糖碎片和苷元離子。本研究共鑒定和推測出25個皂苷類化合物，包括PPT型9個（30～38），PPD型11個（39、41、42、44～49、51、54），OA型4個（43、50、52、55），其他型1個（56）。以化合物32為例，在負離子模式下，產生加和離子峰/845.489 3 [M＋HCOO]?，根據其元素組成推導其分子式為C42H72O14。母離子碎裂產生[M－H]?準分子離子峰/799.486 6，隨后相繼丟失六碳糖產生/637.434 5 [M－H－Glc]?與PPT苷元離子/475.381 5 [M－H－2Glc]?。根據以上質譜碎片信息以及與對照品比對，32鑒定為PPT型人參皂苷Rg1。化合物54負離子模式下，產生加和離子峰/829.496 3 [M＋HCOO]?，根據其元素組成推導其分子式為C42H72O13。母離子碎裂產生[M－H]?準分子離子峰/783.489 1，隨后相繼丟失六碳糖產生/621.434 3 [M－H－Glc]?與PPD苷元離子/459.380 0 [M－H－Glc－Glc]?。根據以上質譜碎片信息，54鑒定為PPD型人參皂苷Rg3。化合物43在負離子模式下，產生[M－H]?準分子離子峰/955.487 1；母離子碎裂產生/793.431 8[M－H－Glc]?、569.382 1 [M－H－Glc－Glc－CO2－H2O]?與苷元離子455.351 5 [M－H－Glc－Glc－GlurA]?。根據以上質譜碎片信息以及與對照品比對，43鑒定為OA型人參皂苷Ro。化合物56在負離子模式下，產生[M＋HCOO]?加和離子峰/811.479 6，母離子碎裂產生/765.477 7 [M－H]?準分子離子峰、隨后丟失六碳糖產生/603.429 7 [M－H－Glc]?。根據以上質譜碎片信息結合文獻報道[12]，56鑒定為人參皂苷Rg5。

3.1.2 氨基酸及其衍生物 在人參配方顆粒標準湯劑中共鑒定出12個氨基酸及其衍生物（1～3、10、11、15～17、19、20、24、27）。在正離子模式下，化合物27產生/205.098 2 [M＋H]+的準分子離子峰，對應分子式C11H12N2O2；其主要的二級碎片有/188.071 2 [M＋H－NH3]+、159.094 0 [M＋H－HCOOH]+、118.065 0 [M＋H－C3H5NO2]+，結合數據庫匹配及其碎片信息并參考文獻[14,15]，27鑒定為色氨酸。化合物3在正離子模式下產生499.225 0 [M＋H]+的準分子離子峰，對應的分子式為C18H34N4O12。其主要的二級碎片有/337.172 3 [M＋H－Glc]+、175.121 2 [M＋H－Glc－Glc]+、158.091 4 [M＋H－Glc－Glc－NH3]+，其中/175.120 7的碎片表明結構中含有精氨酸，結合數據庫匹配及碎片信息并參考文獻數據[16]，推測3為精氨酸葡萄二糖苷。

3.1.3 堿基及核苷 在人參配方顆粒標準湯劑中共鑒定出5個堿基及核苷類成分（12、18、21、23、25）。化合物21在正離子模式下產生/268.104 8 [M＋H]+的準分子離子峰，對應分子式C10H11N5O4；其主要的二級碎片離子/136.063 5分子組成與腺嘌呤堿基一致。因此，結合數據庫匹配和二級碎片并參考文獻數據[16,22]，21鑒定為腺苷。

3.1.4 其他類 在人參配方顆粒標準湯劑中共鑒定出15個其他類成分（4～9、13、14、22、26、28、29、40、53、57）。其中，化合物7在負離子模式下產生/341.106 9 [M－H]?的準分子離子峰，對應分子式C12H22O11。其主要的二級碎片離子/179.053 0 [M－H－Glc]?、119.028 9 [M－H－Glc－C2H4O2]?、59.003 4 [M－H－Glc－C4H8O4]?。基于上述碎片信息，結合數據庫匹配并參考文獻[19]，7鑒定為蔗糖。化合物14在負離子模式下產生/191.018 1 [M－H]?的準分子離子峰，對應分子式C6H8O7。其主要的二級碎片離子/173.008 5 [M－H－H2O]?、/129.016 4 [M－H－H2O－CO2]?、/111.002 0 [M－H－2H2O－CO2]?、/87.000 3 [M－H－2H2O－2CO2]?。基于上述碎片信息，結合數據庫匹配并參考文獻數據[18,20]，14鑒定為檸檬酸。

3.2 人參配方顆粒指紋圖譜的建立

3.2.1 色譜條件優化 分別以乙腈-0.01%磷酸水溶液、乙腈-0.02%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等流動相系統進行梯度洗脫試驗，流動相為乙腈- 0.01%磷酸水溶液時，色譜峰分離較佳，因此選定的流動相為乙腈-0.01%磷酸。同時，考察了25、30、35、40 ℃不同柱溫對分離的影響，色譜峰分離受柱溫影響較大，溫度越高，分離度越佳。由于40 ℃條件較為極端，因此選擇條件較溫和、分離度較佳的35 ℃。并通過梯度優化，確定最佳的洗脫梯度為0～20 min，20%～24%乙腈；20～33 min，24%～28%乙腈；33～60 min，28%～36%乙腈。

3.2.2 精密度試驗 取樣品S1作為供試品，精密稱取1份樣品，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，進樣分析。結果表明，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積無明顯變化，以2號峰人參皂苷Re為參照峰，其RSD均小于2.0%，表明儀器穩定，精密度良好。

3.2.3 重復性試驗 取精密度試驗中同一批作為供試品，精密稱取6份樣品，按供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，進樣分析。結果表明，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積無明顯變化，以2號峰人參皂苷Re為參照峰，其RSD均小于2.0%，表明方法重復性良好。

3.2.4 穩定性試驗 取精密度試驗中同一批樣品作為供試品，按“2.2”項方法制備成供試品溶液，分別在0、3、6、9、12、15、18、24 h進樣分析。以2號峰人參皂苷Re為參照峰，各主要色譜峰相對保留時間和其相對峰面積RSD均小于2.0%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

3.2.5 指紋圖譜的建立及相似度評價 將18批人參配方顆粒按“2.2”項方法制成供試品溶液，按“2.3”項指紋圖譜的色譜條件對其進行檢測，記錄色譜圖，數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”，以S1號樣品的色譜圖為參照圖譜進行全譜峰匹配，以平均值法生成對照圖譜（圖2）并計算相似度。結果表明，經過與對照品比對，指認了8 個共有峰：1號峰為人參皂苷Rg1，2號峰為人參皂苷Re，3號峰為人參皂苷Rf，4號峰為人參皂苷Rb1，5號峰為人參皂苷Ro，6號峰人參皂苷Rc，7號峰為人參皂苷Rb2，8號峰為人參皂苷Rd。18批人參配方顆粒樣品的指紋疊加圖譜，見圖3，各批樣品與對照圖譜的相似度分別為0.917、0.917、0.927、0.983、0.994、0.994、0.997、0.997、0.993、0.989、0.989、0.993、0.990、0.972、0.989、0.994、0.992、0.984，樣品相似度均大于0.900。

1-人參皂苷Rg1 2-人參皂苷Re 3-人參皂苷Rf 4-人參皂苷Rb1 5-人參皂苷Ro 6-人參皂苷Rc 7-人參皂苷Rb2 8-人參皂苷Rd

圖3 不同廠家18批人參配方顆粒指紋圖譜

4 討論

目前，人參化學研究多集中于藥材中皂苷成分，人參配方顆粒的研究多集中于其藥效作用，而人參配方顆粒中的化學物質基礎尚不明確[26-29]。液質聯用技術將液相色譜對復雜樣品的高分離能力與質譜的高分辨率、高靈敏度以及能提供化合物的元素組成及離子碎片信息等特點結合起來，可用于化合物的快速鑒定，目前已被廣泛應用于中藥化學成分鑒定和指紋圖譜研究[30-32]。本研究運用UPLC-Q-TOF/MS技術，采用正、負離子2種模式進行質譜掃描，通過數據庫檢索、對照品比對和MS DIAL軟件輔助解析等方法快速分析人參配方顆粒中的化學成分，共鑒定出57個化合物，包括皂苷25個、氨基酸及其衍生物12個、堿基及核苷5個、其他類成分15個，為后續人參配方顆粒的質量控制與藥效研究提供了物質基礎信息。

中藥配方顆粒由于失去了原有飲片所具有的形態學指紋，需要建立完善可行的質量標準，以控制藥品的安全性、穩定性、有效性[33]。指紋圖譜能夠較為全面地反映中藥整體的質量信息，因此可被用于對中藥配方顆粒的質量控制[34-37]。基于此，本研究建立了人參配方顆粒指紋圖譜，在進行指紋圖譜條件建立的過程中，本研究對不同流動相體系、柱溫、洗脫梯度等色譜參數進行了優化，從而獲得峰形較好、色譜峰分離度較佳的指紋圖譜條件。并應用于不同廠家的人參配方顆粒質量控制中。不同廠家不同批次的成分基本相同，僅含量上存在一定差異，可能與原藥材的來源不同或輔料加入量有關；本研究仍存在配方顆粒樣品批次過少，代表性不夠等問題。與現有人參配方顆粒標準[38]相比，本方法分析時間較短，色譜峰分離情況更佳，可以應用于提升人參配方顆粒質量控制水平。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Study on chemical components and chromatographic fingerprints of Ginseng Dispensing Granules based on UPLC-Q-TOF-MS

WANG Jing1, 2, YAO Chang-liang2, ZHANG Jian-qing2, LI Jia-yuan2, YAO Shuai2, GUO De-an1, 2

1. School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2. National Engineering Research Center of TCM Standardization Technology, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201203, China

Ultra performance liquid chromatography tandem quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF-MS) was adopted to rapidly characterize the chemical constituents from standard decoction of Ginseng Dispensing Granules, elucidate the chemical basis of Ginseng Dispensing Granules, and establish an HPLC fingerprint for their quality control.An ACQUITY UPLC HSS T3 (100 mm×2.1 mm, 1.8 μm) column was used for the gradient elution with acetonitrile (A)-0.1% formic acid (B) as the mobile phases, and the data was collected in positive and negative modes. The chemical constituents of Ginseng Dispensing Granules were analyzed and identified by MS DIAL software, comparing with reference standards and searching database. The HPLC fingerprint was established on an ACQUITY UPLC HSS T3 column (2.1 mm×150 mm, 1.8 μm) with acetonitrile ?0.01% phosphoric acid as the mobile phases.A total of 57 compounds, including 25 saponins, 12 amino acids and their derivatives, five bases and nucleosides, together with 15 other compounds, were identified in the standard decoction of Ginseng Dispensing Granules. The HPLC fingerprint of Ginseng Dispensing Granules was established with eight common peaks, respectively ginsenoside Rg1, ginsenoside Re, ginsenoside Rf, ginsenoside Rc, ginsenoside Ro, ginsenoside Rb1, ginsenoside Rb2, and ginsenosede Rd. And the precision, stability and reproducibility of the HPLC fingerprint were acceptable. The components in different batches of Ginseng Dispensing Granules from different manufacturers were basically similar, and only slight differences existed in contents.The results of this study clarified the chemical substance basis of Ginseng Dispensing Granules, and the established HPLC fingerprint provided a method reference for the quality control of Ginseng Dispensing Granules.

Ginseng Dispensing Granules; fingerprint; UPLC-Q-TOF-MS; HPLC; ginsenoside; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rf; ginsenoside Rc

R284.1

A

0253 - 2670(2022)11 - 3286 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.11.003

2022-02-15

國家自然科學基金重點項目（82130111）；國家自然科學基金青年科學基金資助項目（82003938）

王 靜，女，碩士研究生。E-mail: jingwang0105@163.com

果德安，男，研究員，博士生導師，主要從事中藥化學與現代質量標準研究。Tel: (021)50271516 E-mail: daguo@simm.ac.cn

[責任編輯 王文倩]