大腸菌群的檢驗方法及標準的理解

李朝國 張麗娜

大腸菌并不是一個細菌學分類的名字，并不代表某一個或某一屬的細菌，而是指具有一部分特征的一組與糞便污染相關的細菌，包含的細菌種類較多，有檸檬酸桿菌、大腸埃希氏菌、產氣克雷伯氏菌以及陰溝長桿菌等，但這一些細菌在生化或血清學方面并不完全一致。

這些細菌的出現表示某一物品受到污染，例如在食品中檢驗出大腸菌群則表示該食品已經受到人或溫血動物的糞便污染，其中最常見的是大腸桿菌，這一細菌屬于近期污染，而其他的菌屬則歸為陳舊污染。為保證群眾食品等的安全則需要加強對大腸菌群的檢驗，那么大腸菌群如何檢驗呢？檢驗的標準是什么呢？下面對這一問題進行敘述。

大腸菌群檢測的意義是什么

糞便是動物的腸道排泄物，其中可帶有致病菌，常會出現腸道致病菌，因此食物中出現糞便污染時則提示該食品存在腸道致病菌污染的可能性，潛伏食物中毒及流行病的威脅。

大腸菌群是一種革蘭氏染色陰性，無芽孢桿菌，能夠在EMB瓊脂上出現典型的菌落，呈深紫黑色或中心深紫色，表面光滑且有金屬光澤。大腸菌群是一群需氧或兼性厭氧，能夠在常溫37℃的環境下分解出乳糖產酸、產氣的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌，能夠在生活飲用水、食品等的物質中檢出。

大腸菌群中主要以埃希氏菌屬為主，埃希氏菌屬為典型的大腸桿菌，大腸桿菌都是直接或間接來自人或溫血動物的糞便，部分大腸菌群來自典型大腸桿菌排出體外7～30 d后在環境中變異。大腸菌群的分布范圍較廣，除溫血動物糞便外，在自然界環境中也廣泛存在，多項研究調查表明，大腸菌群也可存在于人類、溫血動物經常活動的場所中，是導致社會腸道傳染性疾病流行的主要原因之一，分辨中以大腸桿菌為主，而外界環境中則主要以大腸菌群及其他類別為主。

對其進行檢驗主要是為了判斷食品是否受到糞便的污染，同時加強食品在生產加工、運輸及保存過程中的衛生狀態。通過控制食品安全質量從而降低社會中的腸道傳染性疾病發生率。最初大腸菌群是作為腸道致病菌因此常使用于水質的檢驗中，隨著多年研究的不斷深入，目前大腸菌群已經成為國內外多個國家廣泛使用的作為食品衛生質量檢驗的指示菌。檢驗大腸菌群的意義在于作為食品被糞便污染的指示菌，制藥食品中糞便含量在10～30 mg/kg即可檢出大腸菌群。

大腸菌群的檢驗方式

目前，我國標準最常見的大腸菌群檢驗方式包括三步法檢驗，即乳糖發酵試驗、分離培養及證實試驗。

①乳糖發酵試驗：檢驗方式為將所需檢驗的樣品稀釋完成后選擇不同的三個稀釋度，每一個稀釋度連接三管乳糖膽鹽發酵管，并將其放置在37℃的溫度下保存兩天，觀察是否產氣以判斷是否受到大腸菌群污染。

②分離培養：將產氣發酵管培養物轉種與伊紅美藍瓊脂平板上在37℃的溫度下保存一天，隨后觀察菌落的形態，根據形態的變化判斷是否存在大腸菌群污染。

③證實試驗：該種方式主要是挑選平板中可疑的菌落用革蘭氏染色觀察，并接種乳糖發酵管在37℃的溫度下保存一天，觀察產氣情況。

原國家商檢局制定的檢驗標準主要是采取美國的FDA檢驗方式，用兩步法，包括推測試驗及證實試驗。

①推測試驗：將所需檢驗的樣品稀釋后選擇3個稀釋度，每個稀釋度需接種三觀的LST肉湯，并在37℃的溫度下保存兩天，觀察是否出現產氣的現象。

②證實試驗：將產氣管培養物接種煌綠乳糖膽鹽肉湯管，在37℃的溫度下保存兩天，觀察是否產氣，以煌綠乳糖膽鹽產氣作為陽性。

ATP熒光檢測儀

ATP熒光檢測儀是一種在螢火蟲發光原理的基礎上快速檢驗的技術，能夠清晰的表明檢驗樣本中微生物及其他生物的殘余量，從而判斷該食品的衛生質量。螢火蟲會發光是由于螢火蟲本身能夠將化學物質的化學能轉變為光能的生物催化劑，這種催化劑稱之為螢火蟲熒光素酶，同時還能夠產生蟲熒光素以及三磷酸腺苷，在有氧的條件下蟲光素酶催化蟲熒光素能夠與ATP產生氧化反應，因此能夠形成氧化熒光素發出熒光，協助臨床檢驗。

可見，只需要具備適當的條件，當反應系統中蟲光素酶和蟲熒光素過量時，熒光的強弱直接取決于ATP的數量，而在大腸菌群的檢驗中，以檢驗的細菌樣品為例，當檢驗樣本中的細菌細胞越多時，ATP的量越高，同時發出的熒光也就更強。這主要是由于蟲光素酶對ATP的反應較靈敏，熒光強弱能夠通過熒光劑在10～15s的時間內計算。因此，在排除樣品中非細菌ATP干擾的狀態下，通過熒光值就能夠確定樣品中細菌ATP的含量，以確定大腸菌群的數量。

但在檢驗過程中需要注意的是，在檢驗完成后需將微量熒光檢測儀做適當的清潔以避免下次使用檢驗時污染。同時，在使用檢驗前應套上無菌移液管尖，使用移液器吸取或轉移試劑、樣品時務求準確，避免移液器與樣品或試劑出現交叉污染現象。另外，在完成檢驗后應立即取下過濾比色杯，在未取下前應避免晃動或倒置，避免微量熒光檢驗儀內試劑濺出后污染光學部件。

結論

大腸菌群并不作為單個細菌存在，而是衛生細菌一組的分類用語，也是作為糞便污染指標菌提出的，因此大腸菌群主要是用于檢驗食品中是否出現糞便污染。同時，大腸菌群數量的高低也直接表明了食品被污染的嚴重程度，反應出了對人體健康危害性的大小，因此必須加強對大腸菌群的檢驗。而ATP熒光檢測儀在大腸菌群的檢驗中具有較高的檢出率，能夠在較短的時間內檢出，檢驗過程中可能受到外界的影響因素較少，更有利于相關機構對腸道傳染性疾病的控制。