自動(dòng)化磁珠法標(biāo)本制備聯(lián)合液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)人血清中25-羥基維生素D的性能評(píng)價(jià)

盧 山，董輝苒，任文華，蘇 玉，李春艷，萬(wàn)極碩，吳 俊

北京積水潭醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100035

維生素D作為人體必需的營(yíng)養(yǎng)素，對(duì)人體鈣和磷的正常代謝有直接影響。維生素D缺乏十分常見，因此維生素D水平的準(zhǔn)確檢測(cè)對(duì)多種鈣代謝相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有著重要的意義。維生素D在血液循環(huán)中的主要形式以25-羥基維生素D[25-(OH)D]呈現(xiàn)，其半衰期最長(zhǎng)，濃度最高，且最穩(wěn)定，能反映人體的維生素D總量。25-(OH)D的主要形式為25-(OH)D2和25-(OH)D3，所以評(píng)價(jià)體內(nèi)維生素D營(yíng)養(yǎng)狀況最為有效的指標(biāo)是血清中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平[1]。

近年來(lái)，維生素D的檢測(cè)越來(lái)越受到人們的重視。國(guó)家在2015年發(fā)布了血清中25-(OH)D3檢測(cè)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[2]。目前液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)有通用性強(qiáng)、特異度和靈敏度高的優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)檢測(cè)25-(OH)D2和25-(OH)D3，是國(guó)際上維生素D檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)[3-10]。然而在臨床檢測(cè)維生素D的過(guò)程中，LC-MS/MS存在的問題是前處理過(guò)程復(fù)雜。目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)室是通過(guò)手工操作完成加樣和取樣步驟，臨床操作人員需要較高的技能要求，因此容易出現(xiàn)人為失誤導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不好。近年來(lái)，自動(dòng)化磁珠法(MSPE)標(biāo)本制備的出現(xiàn)有望將LC-MS/MS技術(shù)發(fā)展成為前處理和檢測(cè)一體的全自動(dòng)檢測(cè)方法，受到臨床的極大重視，該法前處理過(guò)程簡(jiǎn)單，可節(jié)省人力和時(shí)間成本。因此，本研究評(píng)估了使用MSPE進(jìn)行標(biāo)本前處理后25-(OH)D2和25-(OH)D3的檢測(cè)結(jié)果，并與液液萃取法(LLE)和傳統(tǒng)固相支撐液液萃取法(SLE)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，以期為臨床選擇不同的標(biāo)本處理方法提供幫助。

1 材料與方法

1.1材料來(lái)源 血清標(biāo)本為當(dāng)天臨床檢測(cè)剩余血清，選取避免溶血、乳糜、黃疸的120份臨床血清標(biāo)本分裝后于-20 ℃冰箱保存待用。

1.2儀器與試劑 LC-MS/MS系統(tǒng)(美國(guó)AB SCIEX)；自動(dòng)化磁珠法質(zhì)譜標(biāo)本前處理系統(tǒng)ZPTQ 32(北京梅斯質(zhì)譜生物)；低速離心機(jī)(北京京立)；微孔板振蕩器、氮吹儀(杭州奧盛儀器)；LLE的25-(OH)D測(cè)定試劑盒(江蘇豪思生物)。SLE所用提取板為Cleanert SLE 96Wellplate(天津博納艾杰爾)。MSPE的25-羥維生素D測(cè)定試劑盒(北京梅斯質(zhì)譜生物)。

1.3方法

1.3.1LLE法標(biāo)本處理過(guò)程 按照常規(guī)的LLE操作流程進(jìn)行操作，首先將100 μL標(biāo)本添加至小型離心管中，再在其中加入100 μL含內(nèi)標(biāo)的甲醇，然后添加600 μL乙酸乙酯，震蕩后離心取400 μL上清液，氮吹后用100 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶。質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品同步按操作處理。

1.3.2SLE法標(biāo)本處理過(guò)程 SLE法按Cleanert SLE 96Wellplate使用要求進(jìn)行操作，首先將100 μL標(biāo)本加入預(yù)設(shè)的96孔處理板中的標(biāo)本位置，再在其中加入同位素內(nèi)標(biāo)，然后每孔加入100 μL純水稀釋靜置5 min，之后每孔采用1 200 μL正己烷淋洗，收集淋洗液氮?dú)獯蹈?，?00 μL初始流動(dòng)相復(fù)溶。質(zhì)控和標(biāo)準(zhǔn)品同步按操作處理。

1.3.3MSPE標(biāo)本處理過(guò)程 按照試劑盒操作規(guī)程操作。首先將100 μL標(biāo)本加入預(yù)設(shè)的96孔中的標(biāo)本位置，再在其中加入同位素內(nèi)標(biāo)，之后將96孔板轉(zhuǎn)移至梅斯ZPTQ 32儀器進(jìn)行自動(dòng)標(biāo)本處理。質(zhì)控和標(biāo)本同步按操作處理。

1.3.4LC-MS/MS 色譜柱采用Kinetex 2.6 μm C18100A 30×2.1 mm規(guī)格，含0.1%甲酸的水溶液為流動(dòng)相A，以含0.1%甲酸的甲醇為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫：0～<0.3 min，40%流動(dòng)相A；0.3～<1.5 min，0%～<40%流動(dòng)相A；1.5～2.5 min，0% 流動(dòng)相A；2.5～3.5 min，40%流動(dòng)相A,流速0.5 mL/min。采用正離子大氣壓化學(xué)電離離子化的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，25-(OH)D2和25-(OH)D3定量離子通道質(zhì)荷比分別為395.2∶269.3和383.3∶365.3；定性離子通道質(zhì)荷比分別為395.2∶337.2和383.3∶257.2；內(nèi)標(biāo)離子通道質(zhì)荷比分別為398.2∶272.3和389.3∶371.3。離子源溫度：500 ℃，離子源電壓5 500 V，氣簾氣30，霧化氣55，輔助氣20。

1.4性能驗(yàn)證 性能驗(yàn)證過(guò)程參考《液相色譜-質(zhì)譜臨床應(yīng)用建議》[11]和《液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜臨床檢測(cè)方法的開發(fā)與驗(yàn)證》[12]指南。

1.4.1線性、定量限和檢測(cè)限評(píng)價(jià) 以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為X軸，標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為Y軸，進(jìn)行線性回歸分析，經(jīng)“1/X2”權(quán)重得回歸方程。將樣品待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的峰面積比代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算標(biāo)本中25-(OH)D2和25-(OH)D3水平，r>0.99。以信噪比≥3時(shí)的濃度設(shè)為檢測(cè)限，以信噪比≥10時(shí)的濃度設(shè)為定量限，且連續(xù)10次測(cè)定的變異偏差<20%。

1.4.2精密度評(píng)價(jià) 混合血清標(biāo)本，平均分為2份，其中1份作為低水平標(biāo)本，另1份添加適量標(biāo)準(zhǔn)品混合物作為高水平標(biāo)本，將2個(gè)水平標(biāo)本混勻，分裝至凍存管，置于-80 ℃保存。每天各取出1支，制備8個(gè)平行管，測(cè)定3批次，計(jì)算該方法的精密度。

1.4.3絕對(duì)回收率評(píng)估 取來(lái)源于不同患者的血清標(biāo)本，每份不少于1 mL，震蕩混勻備用。標(biāo)本再分為空白對(duì)照和MSPE提取前加標(biāo)準(zhǔn)品[添加2個(gè)10 μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，25-(OH)D2為3/13 ng/mL，25-(OH)D3為5/30 ng/mL]和MSPE提取后加標(biāo)準(zhǔn)品[添加2個(gè)10 μL不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品，25-(OH)D2為3/13 ng/mL；25-(OH)D3為6/30 ng/mL]，最終用水補(bǔ)齊復(fù)溶體積。比較磁珠提取前加標(biāo)準(zhǔn)品(去除空白本底)與MSPE提取后加標(biāo)準(zhǔn)品(去除空白本底)峰面積的差異。

1.4.4相對(duì)回收率和準(zhǔn)確度評(píng)估 通過(guò)測(cè)定混合血清和混合血清添加25-(OH)D2和25-(OH)D3的2個(gè)水平混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液各10 μL[加入標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)理論水平25-(OH)D2為3/13 ng/mL，25-(OH)D3為6/30 ng/mL]，每種處理各制備3個(gè)平行管，計(jì)算加樣回收率及與預(yù)期濃度的偏差。

1.4.5基質(zhì)效應(yīng)評(píng)估 采用標(biāo)本處理后加入法。取4份來(lái)源于不同個(gè)體的血清標(biāo)本，每份標(biāo)本分為3份，經(jīng)過(guò)MSPE提取，其中1份加入水，1份加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品25-(OH)D2(3 ng/mL)，25-(OH)D3(6 ng/mL)，另1份加入10 μL標(biāo)準(zhǔn)品 25-(OH)D2(13 ng/mL)，25-(OH)D3(30 ng/mL)，3份均加入10 μL混合內(nèi)標(biāo)。標(biāo)本中去除空白中的信號(hào)值后與溶劑中標(biāo)準(zhǔn)品峰面積(或峰面積內(nèi)標(biāo)比)進(jìn)行比較，分析方法的基質(zhì)效應(yīng)。

1.4.6方法比對(duì) 收集臨床檢測(cè)剩余血清標(biāo)本120例，各待測(cè)物濃度在檢測(cè)范圍內(nèi)分布相對(duì)均勻，采用LLE、SLE和MSPE同時(shí)進(jìn)行處理，然后采用相同LC-MS/MS方法進(jìn)行檢測(cè)，比較3種提取方法檢測(cè)結(jié)果的一致性。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用MedCalc進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和作圖，采用Bland&Altaman作圖比較3種方法的差異，以Passing &Bablok回歸分析3種方法之間的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1血清標(biāo)本經(jīng)MSPE提取后的典型色譜峰圖 25-(OH)D2和25-(OH)D3的出峰時(shí)間分別為1.90 min、1.86 min，兩種待測(cè)物峰形對(duì)稱，各成分分離良好，互不干擾，且與SLE方法提取后的檢測(cè)結(jié)果比較，MSPE提取后未發(fā)現(xiàn)雜峰明顯增多。

2.2MSPE提取25-(OH)D2和25-(OH)D3性能評(píng)價(jià)結(jié)果

2.2.1線性、定量限和檢測(cè)限 25-(OH)D2和25-(OH)D3分別在1.0～36.0 ng/mL，2.5～90.0 ng/mL范圍內(nèi)相關(guān)性良好，r在各批次均>0.99。25-(OH)D2和25-(OH)D3檢測(cè)限分別為0.15 ng/mL、0.15 ng/mL；定量限分別為0.4 ng/mL、0.9 ng/mL，對(duì)應(yīng)變異系數(shù)分別為11.71%、7.96%。

2.2.2精密度 25-(OH)D2和25-(OH)D3批內(nèi)重復(fù)精密度分別在5.3%～6.5%、5.1%～6.8%；實(shí)驗(yàn)室內(nèi)總不精密度分別在7.3%～10.6%、6.1%～8.0%，見表1。

表1 MSPE提取LC-MS/MS測(cè)定25-(OH)D的結(jié)果

2.2.3絕對(duì)回收率 25-(OH)D2絕對(duì)回收率在27.7%～31.3%，25-(OH)D3絕對(duì)回收率在21.7%～34.3%。

2.2.4相對(duì)回收率和準(zhǔn)確度 25-(OH)D2和25-(OH)D3相對(duì)回收率分別在97.0%～104.0%、96.5%～106.3%，百分偏差均在±15%以內(nèi)，見表2。

表2 MSPE提取LC-MS/MS測(cè)定25-(OH)D的結(jié)果

2.2.5基質(zhì)效應(yīng) 25-(OH)D2和25-(OH)D3在大氣壓化學(xué)電離檢測(cè)下幾乎沒有基質(zhì)效應(yīng)的抑制，甚至還有些基質(zhì)增強(qiáng)的趨勢(shì)，另外經(jīng)過(guò)同位素內(nèi)標(biāo)校正后，相對(duì)基質(zhì)效應(yīng)均在100%左右，亦可抵消潛在的基質(zhì)效應(yīng)，見表3。

表3 MSPE提取LC-MS/MS檢測(cè)25-(OH)D的基質(zhì)效應(yīng)(%)

2.2.6方法比對(duì) LLE、SLE和MSPE這3種方法提取臨床120例血清標(biāo)本中25-(OH)D2和25-(OH)D3的結(jié)果比較，其中SLE和MSPE相關(guān)性均良好(r>0.99)，2種方法比較25-(OH)D相對(duì)百分偏差在±15%以內(nèi)，LLE和MSPE相對(duì)來(lái)說(shuō)結(jié)果偏差較大(r>0.98)，2種方法比較25-(OH)D相對(duì)百分偏差在±25%以內(nèi)。見圖1～4。

圖1 MSPE和SLE結(jié)果的相關(guān)性

圖2 MSPE和SLE的Bland&Altaman分析

圖3 MSPE和LLE結(jié)果的相關(guān)性

圖4 MSPE和LLE的Bland&Altaman分析

3 討 論

目前免疫法和色譜法是檢測(cè)血清中25-(OH)D常用的方法，免疫法中有放射免疫法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法及電化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定法[13]，色譜法中包括高效液相色譜法和LC-MS/MS[9-12]。其中，免疫類方法的優(yōu)點(diǎn)是初始投入成本低、高自動(dòng)化、重現(xiàn)性好，然而特異度和靈敏度不高，不能準(zhǔn)確測(cè)定25-(OH)D2水平，測(cè)試標(biāo)本后期成本較高，回收率較差等是其不可避免的缺點(diǎn)；高效液相色譜法優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、速度快等，缺點(diǎn)是靈敏度不高、且不能很好的定性等；LC-MS/MS具有靈敏度高、特異度強(qiáng)、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，能同時(shí)監(jiān)測(cè)25-(OH)D2和25-(OH)D3，缺點(diǎn)是對(duì)檢測(cè)人員技術(shù)要求高，儀器成本高[14-15]。LC-MS/MS技術(shù)檢測(cè)25-(OH)D已受到臨床醫(yī)生及檢驗(yàn)人員的共同認(rèn)可，然而復(fù)雜的前處理過(guò)程限制了LC-MS/MS在臨床的廣泛應(yīng)用，MSPE技術(shù)的出現(xiàn)為L(zhǎng)C-MS/MS技術(shù)的自動(dòng)化進(jìn)程帶來(lái)了革命性的突破。

目前，LC-MS/MS方法進(jìn)行檢測(cè)前均需要進(jìn)行標(biāo)本前處理。目前常用的前處理方法主要有固相萃取、液液萃取(包括SLE)、蛋白沉淀及免疫捕獲等。對(duì)于水平較低的25-(OH)D及激素類物質(zhì)往往需要使用較為繁瑣的前處理方法，對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器配置和操作人員要求較高，并且不利于實(shí)現(xiàn)完全自動(dòng)化。

本研究中MSPE通過(guò)在磁珠表面進(jìn)行化學(xué)基團(tuán)修飾，待測(cè)物與磁珠表面鍵合相發(fā)生吸附解吸附，模擬固相萃取的過(guò)程，其不同于免疫試劑中抗體包被MSPE的原理。首先活化平衡磁珠，然后加入待測(cè)標(biāo)本，經(jīng)過(guò)充分混合后，待測(cè)物與磁珠互相吸附，之后通過(guò)不同極性強(qiáng)度的洗脫溶液對(duì)磁珠淋洗洗脫，以達(dá)到分離和純化的目的。MSPE有別于傳統(tǒng)固相萃取，通過(guò)磁珠的轉(zhuǎn)移來(lái)實(shí)現(xiàn)目標(biāo)待測(cè)物的分離，不僅過(guò)程簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高，MSPE和LC-MS/MS聯(lián)合使用有望成為一種前處理和檢測(cè)分析一體的全自動(dòng)檢測(cè)方法。

綜上所述，本研究驗(yàn)證了MSPE提取25-(OH)D的性能，MSPE和SLE這兩種提取方法具有良好相關(guān)性，所得結(jié)果基本一致。MSPE有望在未來(lái)規(guī)?；瘧?yīng)用于LC-MS/MS的自動(dòng)化前處理過(guò)程，減少手工操作的誤差，助力于臨床應(yīng)用。