宮頸癌組織中Zac1和LEF1的表達及臨床意義*

劉 燕，朱 莉，田 冰

湖南省常德市婦幼保健院病理科，湖南常德 415000

宮頸癌是女性較為常見的腫瘤。全球范圍內，宮頸癌每年約50萬新發病例，每年死亡例數高達26萬例[1]。臨床上，宮頸癌的治療以手術治療為主，近年來，靶向藥物和免疫檢查抑制劑在臨床的廣泛使用，使腫瘤患者獲得良好的治療療效及生存預后[2]。但在治療過程中宮頸癌患者仍存在治療抵抗或不敏感的現象[3]。深入研究宮頸癌的發病機制，對宮頸癌的診斷和治療意義重大。多形性腺瘤基因樣鋅指因子1(Zac1)的編碼基因位于人類6號染色體，該基因蛋白具有典型的鋅指蛋白結構。Zac1在胚胎組織及女性子宮內膜組織中表達較高。腫瘤中Zac1主要發揮抑癌基因作用。研究表明，在肝癌[4]、結直腸癌[5]和腎細胞癌[6]等惡性腫瘤中Zac1表達下調，引起腫瘤細胞的無限增殖，抑制腫瘤細胞的凋亡，導致腫瘤患者的預后不良[5]。淋巴增強子結合因子1(LEF1)的編碼基因位于4q25，該基因編碼蛋白能結合并激活T細胞受體-α增強子，在細胞分化和毛囊形態發生中發揮作用[7]。LEF1在前列腺癌[8]、膀胱癌[9]等惡性腫瘤中表達上調，通過激活Wnt途徑，促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，促進腫瘤細胞侵襲及轉移，導致腫瘤進展[10]。本研究通過檢測宮頸癌中Zac1、LEF1的表達，分析兩者與宮頸癌患者預后的關系，探討Zac1、LEF1的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2014年5月至2017年5月于本院診治的83例宮頸癌患者的臨床資料。納入標準：(1)經病理學檢查確診為宮頸癌，由兩位病理醫師共同診斷；(2)無放化療史；(3)宮頸癌患者一般狀況良好，卡氏功能狀態評分>70分。排除標準：(1)合并其他腫瘤；(2)合并宮頸良性病變；(3)合并重度臟器功能衰竭。宮頸癌患者年齡32～75歲，平均(47.1±5.3)歲；宮頸鱗癌60例，宮頸腺癌23例；高中分化50例，低分化33例；腫瘤FIGO分期：Ⅰ期55例，Ⅱ期28例；肌層浸潤深度：淺肌層54例，深肌層29例；合并淋巴結轉移18例，無淋巴結轉移65例。所有宮頸癌患者均簽署知情同意書，符合赫爾辛基宣言原則，經本院醫學倫理委員會審核通過。所有宮頸癌患者出院后均予以隨訪，以門診或電話方式進行，隨訪內容包括生存情況等。隨訪終止日期2021年5月，隨訪3～48個月，中位隨訪時間31.2個月。

1.2方法 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測，取術中黃豆粒大小宮頸癌組織和癌旁組織，癌旁組織距癌組織2 cm以上，經病理檢查明確為正常宮頸組織，組織來源與宮頸癌來源一致。實驗前稱取50 mg組織，組織研缽研磨后，離心去除細胞碎片。用Trizol試劑提取組織中RNA，溶于DEPC水，用Narodrop2000檢測RNA濃度。以RNA為模板，進行反轉錄，合成模板cDNA。然后以cDNA為模板，利用qPCR檢測Zac1、LEF1 mRNA的表達。Zac1上游引物：5′-CCCAGAAATCTCACCAGTGTG-3′，Zac1下游引物：5′-GTGCCTCTTATAGCCCAGCAT-3′，LEF1上游引物:5′-TGCCAAATATGAATAACGACCCA-3′，LEF1下游引物:5′-GAGAAAAGTGCTCGTCACTGT-3′，內參GAPDH上游引物:5′-CTGGGCTATAAGAGGCACCTG-3′，內參GAPDH下游引物:3′-CTTTTCCTTGGTTCCGCTAGG-5′。qPCR引物的設計合成由北京天一輝遠生物公司完成。qPCR反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性40 s，62 ℃退火1 min，70 ℃延伸30 s，35個循環。qPCR反應總體系為10 μL，模板1 μL，前后引物各1 μL，SYBR premix Taq Ⅱ 5 μL，去離子水2 μL。每個標本實驗重復3次。Zac1、LEF1的相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算，ΔCt= CT目的基因-CTGAPDH；ΔΔCt=CT樣品-CT對照。

2 結 果

2.1宮頸癌組織和癌旁組織Zac1和LEF1相對表達水平比較 宮頸癌組織與癌旁組織中Zac1的相對表達水平分別為0.831±0.134、4.613±0.347，LEF1的相對表達水平分別為5.212±0.457、0.968±0.131。宮頸癌中Zac1的相對表達水平明顯低于癌旁組織(t=92.629，P<0.001)，宮頸癌中LEF1的相對表達水平明顯高于癌旁組織(t=81.330，P<0.001)。見圖1。

圖1 宮頸癌組織和癌旁組織中Zac1和LEF1相對表達水平比較

2.2Zac1與LEF1表達之間的相關性 結果表明Zac1與LEF1的表達呈負相關(r=-0.570，P<0.001)。見圖2。

圖2 Zac1與LEF1表達之間的相關性

2.3Zac1、LEF1表達與臨床病理特征間的關系 宮頸癌中Zac1、LEF1的相對表達水平與腫瘤FIGO分期和淋巴結轉移有關。腫瘤FIGO分期Ⅱ期癌組織中Zac1的表達明顯低于FIGO分期Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴結轉移癌組織中Zac1的表達明顯低于無淋巴結轉移(P<0.05)。腫瘤FIGO分期Ⅱ期癌組織中LEF1的表達明顯高于FIGO分期Ⅰ期(P<0.05)；有淋巴結轉移癌組織中LEF1的表達明顯高于無淋巴結轉移(P<0.05)。見表1。

表1 Zac1、LEF1的表達與宮頸癌臨床病理特征的關系

2.4Zac1、LEF1的表達與宮頸癌患者生存預后的關系 本研究中，對83例宮頸癌患者進行隨訪，隨訪過程中無失訪，死亡22例，生存率為73.5%(61/83)。以Zac1相對表達水平的平均數0.831為臨界值，分為低Zac1表達組42例，高Zac1組41例。低Zac1表達組生存率為61.9%(26/42)，明顯低于高Zac1表達組的85.4%(35/41)，差異有統計學意義(χ2=5.801，HR=1.79，95%CI1.13～2.84，P=0.016)。以LEF1相對表達水平的平均數5.212為臨界值，低LEF1表達組40例，高LEF1表達組43例。高LEF1表達組生存率為67.4%(29/43)，明顯低于低LEF1表達組的80.0%(32/40)，差異有統計學意義(χ2=4.431，HR=1.66，95%CI1.04～2.63，P=0.035)。見圖3。

2.5多因素COX回歸分析宮頸癌患者生存預后的影響因素 以宮頸癌患者的生存情況為因變量(賦值1=死亡，0=存活)，納入FIGO分期(賦值1=Ⅰ期，2=Ⅱ期)、淋巴結轉移(賦值1=伴淋巴結轉移，0=無淋巴結轉移)、Zac1(賦值1=低表達，2=高表達)、LEF1(賦值1=高表達，2=低表達)為自變量。多因素Cox回歸分析結果表明，Zac1低表達(HR=2.473，95%CI1.560～4.610)，LEF1高表達(HR=1.780，95%CI1.091～2.283)，FIOG分期Ⅱ期(HR=1.731，95%CI1.112～2.502)及淋巴結轉移(HR=2.810，95%CI1.353～4.816)是宮頸癌患者生存預后的危險因素。見表2。

注：A為Zac1相對表達水平與宮頸癌患者生存預后的關系；B為LEF1相對表達水平與宮頸癌患者生存預后的關系。圖3 Zac1、LEF1相對表達水平與宮頸癌患者生存預后的關系

表2 影響宮頸癌患者生存預后的危險因素

3 討 論

我國是宮頸癌發病率較高的國家，每年發病率高達16.6/100 000，嚴重威脅我國女性的身體健康[11]。隨著我國宮頸癌篩查的普及和人乳頭瘤病毒疫苗的推廣，使得早期預防宮頸癌成為可能。但對于轉移性宮頸癌及復發性宮頸癌患者，傳統的手術及放化療療效較差，5年生存率僅有60%[12]。因此，深入探討宮頸癌發生的分子機制，尋找新的診斷治療靶點，對于指導宮頸癌患者的個體化治療，具有重要的意義。

Zac1由PLAGL1基因編碼，是含有7個鋅指結構的轉錄因子，在多種類型的胚胎組織和子宮內膜組織中高表達。功能上，Zac1作為轉錄因子與靶基因的啟動子區域結合，調控靶基因的表達，在胚胎發育、細胞凋亡和細胞周期停滯中發揮重要調控功能[13]。例如，Zac1可以與核受體(如p53和組蛋白乙酰轉移酶)結合并促進p53的轉錄活性，誘導細胞周期停滯和細胞凋亡[14]。因此，在腫瘤中Zac1是一種重要的腫瘤抑制因子。本研究宮頸癌患者中Zac1的相對表達水平降低。目前在腫瘤中調控Zac1表達的機制還不清楚。LE等[15]發現，Zac1受miR-125b的表達調控，腫瘤中miR-125b表達上調能夠促進Zac1 mRNA的降解，抑制Zac1的表達。此外，Zac1的表達還受到表觀遺傳學修飾的調控，腫瘤中Zac1基因啟動區域CpG島處的高甲基化，能夠明顯抑制Zac1的表達[16]。進一步研究Zac1在宮頸癌中表達的臨床意義發現，Zac1的低表達與宮頸癌較高的腫瘤FIGO分期及淋巴轉移有關，提示Zac1的低表達促進宮頸癌的腫瘤進展。SU等[16]研究表明，腫瘤中Zac1的表達下調能夠促進腫瘤細胞發生上皮間質轉化，提高宮頸癌細胞的遷移及侵襲能力，促進腫瘤的轉移。此外，腫瘤中Zac1的低表達導致其促進p53蛋白轉錄的能力降低，細胞周期阻滯能力喪失，腫瘤細胞過度增殖，致使腫瘤分期升高[14]。因此，Zac1表達的降低與腫瘤的發生和進展相關。本研究利用Kaplan-Meier生存分析亦證實Zac1低表達的宮頸癌患者生存預后較差，并且多因素COX比例風險模型亦證實Zac1低表達是宮頸癌患者生存預后的獨立危險因素。因此，檢測Zac1的表達是評估宮頸癌患者預后的新型生物標志物，針對Zac1的治療可能是一種能夠改善患者預后的治療方案，值得深入研究。

LEF1屬于高遷移率家族的成員，主要通過改變DNA螺旋結構參與基因表達的轉錄調控，在細胞的分化及發育過程中發揮重要的調控功能。LEF1在各種類型的癌癥中異常表達，包括食管鱗狀細胞癌、前列腺癌和肝細胞癌等，并通過促進腫瘤的增殖及轉移，導致腫瘤進展，與腫瘤患者的不良預后有關[17]。本研究宮頸癌患者中LEF1的相對表達水平升高，分析其機制可能與腫瘤中Wnt信號通路的過度激活有關。Wnt/β-Catenin通路在許多癌癥的致瘤特性中起著關鍵作用。研究表明，LEF1是Wnt/β-Catenin通路的下游調節因子，有利于維持腫瘤細胞干細胞特性、腫瘤細胞上皮間質轉化，進而導致腫瘤侵襲轉移的發生[18]。此外，本研究發現LEF1高表達與宮頸癌較高的腫瘤FIGO分期及淋巴結轉移有關，提示宮頸癌中LEF1的高表達促進宮頸癌的進展。一方面，LEF1能夠誘導腫瘤細胞上皮間質轉化過程，致使E-鈣黏素表達降低，而N-鈣黏素表達升高，導致腫瘤細胞黏附能力降低，遷移能力增強，促進腫瘤轉移。另一方面，WANG等[19]研究表明，LEF1能夠通過激活癌基因HRAS的表達，激活ERK/MAPK信號通路，導致腫瘤細胞的過度增殖。因此，本研究證實，LEF1在宮頸癌中可能作為一種促癌基因，促進宮頸癌的腫瘤進展。本研究通過生存分析發現宮頸癌患者中LEF1高表達的患者生存預后較差，并且是宮頸癌患者生存預后的獨立危險因素，表明檢測宮頸癌癌組織中LEF1的表達對宮頸癌具有重要的預后價值。此外，針對LEF1的靶向治療可作為宮頸癌治療的潛在靶點。PARK等[20]報道，LEF1的抑制劑氯硝柳胺能夠逆轉腫瘤細胞的干性特性，對腫瘤起到治療作用。

本研究采用Pearson相關分析發現宮頸癌中Zac1與LEF1的相對表達水平呈負相關。目前兩者的關系尚不清楚，可能是兩者在腫瘤進展過程中存在一定的協同作用。FREIHEN等[21]報道，宮頸癌中Zac1基因處于高度甲基化的狀態導致Zac1的表達降低，進而誘導Wnt通路中的關鍵轉錄因子如Snail的表達上調，Snail激活下游分子LEF1的表達，誘導腫瘤細胞發生上皮間質轉化，進而促進腫瘤進展。但兩者之間的相互作用關系及在宮頸癌中的具體機制仍有待深入研究。

綜上所述，宮頸癌中Zac1表達降低，LEF1表達升高，兩者的表達與腫瘤FIGO分期、淋巴結轉移有關，Zac1低表達、LEF1高表達、腫瘤FIGO分期Ⅱ期及淋巴結轉移是宮頸癌患者生存預后的獨立危險因素，檢測宮頸癌癌組織中Zac1、LEF1的表達是判斷宮頸癌患者預后的標志物。但兩者的臨床應用價值仍需多中心、大樣本的深入研究。