FTO在前列腺癌中的表達(dá)及其臨床意義*

胡 萍，李 會(huì)，楊溪霖，張海寧，卿克勤

四川省成都市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川成都 610041

前列腺癌在西方發(fā)達(dá)國家是最常見的男性腫瘤，約占男性腫瘤的1/3，病死率位于男性腫瘤的第3位[1-2]。隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展、人口老齡化的加劇，前列腺癌的發(fā)病率逐年上升，成為老年男性健康的重要威脅。由于前列腺癌早期癥狀隱匿，且不同地區(qū)前列腺特異抗原篩查存在差異，在我國前列腺癌初診患者人群中，高?；颊哒急容^多[3-4]。目前，前列腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍然不是十分明確。因此，尋找前列腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵因子，將為前列腺癌早期診斷、治療及預(yù)后等提供理論基礎(chǔ)和分子靶標(biāo)。

肥胖相關(guān)蛋白(FTO)是一種位于染色體16q12.2上的N6-甲基腺苷去甲基酶[5]，除了與肥胖癥的發(fā)病相關(guān)，越來越多的研究證實(shí)，F(xiàn)TO基因在乳腺癌、胃癌、急性髓細(xì)胞性白血病(AML)等多種腫瘤中均過表達(dá)，并且參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移，是未來靶向治療研究的重要熱點(diǎn)[6-7]。

為了探索FTO基因與前列腺癌的關(guān)系，本研究首先采用免疫組織化學(xué)染色法檢測前列腺癌癌組織和癌旁組織中FTO的表達(dá)；采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)和蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測FTO在前列腺正常細(xì)胞和癌細(xì)胞中的表達(dá)；采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析FTO的表達(dá)與前列腺癌組織臨床病理特征的關(guān)系；采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測FTO慢病毒干擾質(zhì)粒感染前列腺癌細(xì)胞22RV1后的侵襲能力變化情況?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 前列腺癌癌細(xì)胞PC3、22RV1、Du145和Lncap，前列腺正常細(xì)胞RWPE均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫；組織芯片購自上海芯超生物公司，包括3例前列腺正常組織，52例前列腺癌癌旁組織，55例前列腺癌組織，前列腺癌組織相關(guān)病理參數(shù)見表1；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；FTO慢病毒干擾載體shRNA購自賽業(yè)生物公司。

表1 前列腺癌患者臨床病理特征和前列腺癌FTO的表達(dá)情況(n=55)

1.2方法

1.2.1免疫組織化學(xué)染色 采用免疫組織化學(xué)染色檢測組織芯片中FTO蛋白水平的表達(dá)。組織芯片經(jīng)脫蠟、水化后，采用枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù)抗原，冷卻至常溫。再用3% H2O2處理，避光封閉15 min；PBS洗滌3次，每次5 min；滴加山羊血清，37 ℃封閉30 min后；4 ℃過夜孵育兔抗人FTO單克隆抗體(編號(hào)27226-1-AP,稀釋濃度為1∶100，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加兔通用IgG二抗(上海長島生物科技有限公司)，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌3次，每次5 min，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記的三抗，37 ℃ 孵育30 min；PBS洗滌3次，每次5 min后用DAB顯色；流水沖洗15 min，蘇木精復(fù)染1 min后，流水沖洗30 min，脫水封片，在光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像。最后采用半定量方法評價(jià)FTO的表達(dá)情況，得分評價(jià)如下，F(xiàn)TO的染色強(qiáng)度評估：陰性(0分)、弱陽性(1分)、中陽性(2分)、強(qiáng)陽性(3分)；FTO的陽性染色的百分比：<5%(0分)、5%～<26%(1分)、26%～<51%(2分)、51%～75%(3分)、>75%(4分)。每個(gè)組織標(biāo)本的FTO表達(dá)最終得分等于強(qiáng)度得分×百分比得分，總得分為0～12分，其中<9分為FTO低表達(dá)，≥9分為FTO高表達(dá)。

1.2.2qPCR檢測 采用Triol法提取細(xì)胞總RNA，按照引物反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，取200 ng總RNA經(jīng)Bio-Rad反轉(zhuǎn)錄試劑反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生cDNA，產(chǎn)物在ABI 7500檢測系統(tǒng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，每個(gè)標(biāo)本以GAPDH為內(nèi)參。FTO基因引物序列如下，上游：5′-CCCTGTGAGCAGCAACATAAG-3′,下游：5′-CAACCCGACCCAGTCTAAATC-3′；GAPDH基因引物序列如下，上游：5′-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3′,下游：5′-GGGAAGGATCTGTCTCTGACC-3′；引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。利用相應(yīng)標(biāo)本中GAPDH mRNA的比例計(jì)算組織中mRNA的表達(dá)水平，并將對照組中靶基因的表達(dá)水平設(shè)為1，對其他組中的靶基因的表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化計(jì)算。

1.2.3Western blot 采用細(xì)胞裂解法提取細(xì)胞總蛋白，即加入細(xì)胞RIPA裂解液，經(jīng)勻漿、裂解、離心后，獲得總蛋白，后通過Bradford方法檢測總蛋白濃度，進(jìn)行聚丙烯胺凝膠電泳，經(jīng)恒流電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜上，后將聚偏二氟乙烯膜放入含5%脫脂奶粉的TBST封閉液中封閉，加入一抗加兔抗人FTO單克隆抗體(編號(hào)27226-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，稀釋濃度為1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，加入兔通用二抗(上海長島生物科技有限公司)，37 ℃孵育1 h，洗膜后加入發(fā)光液顯影。最后，采用分析系統(tǒng)軟件測定蛋白條帶的積分光密度值，以GAPDH蛋白條帶作為內(nèi)參對照。

1.2.4FTO干擾慢病毒載體感染 常規(guī)培養(yǎng)22RV1細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%。將其分為實(shí)驗(yàn)組、對照組和空白組3組，利用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染FTO慢病毒干擾載體(pLVX-shRNA-FTO)至實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，使用2 μg嘌呤霉素穩(wěn)定篩選FTO沉默細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，在蛋白水平上驗(yàn)證FTO干擾效果。

1.2.5侵襲實(shí)驗(yàn) 采用Transwell實(shí)驗(yàn)，按照細(xì)胞外基質(zhì)膠∶無血清培養(yǎng)基為1∶7.5的配比在冰上稀釋成使用液。把槍頭剪去一小段(約3 μm)后在冰上吸取每孔40 μL細(xì)胞外基質(zhì)膠使用液輕輕加入24孔板的8.0 μm的Transwell上室中，取實(shí)驗(yàn)組、對照組、空白組的細(xì)胞，分別接種8 000個(gè)細(xì)胞和200 μL DMEM培養(yǎng)基到Transwell上室中，并將500 μL DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)置于下室中，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)24 h，然后取出培養(yǎng)室，用PBS洗滌兩次，用多聚甲醛固定10 min。將小室內(nèi)未發(fā)生侵襲的細(xì)胞用棉簽移除，將小室背面的細(xì)胞用0.1%的結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1FTO在前列腺癌組織中高表達(dá) 與癌旁組織比較，F(xiàn)TO在前列腺癌組織中表達(dá)水平更高，差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.05)，見圖1。

注：A為FTO在前列腺癌組織中的表達(dá)；B為FTO在前列腺癌旁組織中的表達(dá);C為FTO在前列腺癌和癌旁組織的免疫組化評分圖。圖1 FTO在前列腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)比較

2.3高表達(dá)的FTO與前列腺癌的Grade分級(jí)的關(guān)系 據(jù)FTO組化評分，將FTO的表達(dá)分為高表達(dá)組30例和低表達(dá)組25例。結(jié)果表明，F(xiàn)TO的表達(dá)與前列腺癌的Grade分級(jí)有關(guān)，而與年齡、Gleason分級(jí)、淋巴結(jié)個(gè)數(shù)無關(guān)，見表2、3。

2.2FTO在前列腺癌細(xì)胞中高表達(dá) Western blot結(jié)果表明，F(xiàn)TO在前列腺癌細(xì)胞PC3，Du145，22RV1，Lncap中的表達(dá)水平高于前列腺正常細(xì)胞RWPE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；qPCR結(jié)果顯示，F(xiàn)TO在前列腺癌細(xì)胞PC3，Du145，22RV1，Lncap中的mRNA表達(dá)水平高于前列腺正常細(xì)胞RWPE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A為Western blot分析FTO在前列腺正常細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的蛋白表達(dá)圖；B為FTO蛋白表達(dá)水平的定量柱狀圖，和RWPE細(xì)胞比較，aP<0.05；C為qPCR分析FTO在前列腺正常細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的mRNA定量表達(dá)圖，和RWPE細(xì)胞比較，aP<0.05。圖2 FTO在前列腺正常細(xì)胞和前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)

表2 FTO的表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.4FTO的下調(diào)抑制了22RV1細(xì)胞的侵襲能力 Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組和空載組比較，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中FTO的蛋白表達(dá)水平降低；通過Transwell實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果進(jìn)一步表明，感染FTO慢病毒干擾載體(pLVX-shRNA-TFO)的前列腺癌細(xì)胞22RV1的侵襲能力降低。見圖3、4。

表3 Spearman分析FTO的表達(dá)與前列腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

注：A為Western blot分析FTO在對照組、空白組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞中的蛋白表達(dá)圖；B為FTO蛋白表達(dá)水平的定量柱狀圖，aP<0.05。圖3 pLVX-shRNA-TFO感染22RV1細(xì)胞后的FTO蛋白表達(dá)圖

注：A為Transwell分析對照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞侵襲能力；B為侵襲細(xì)胞數(shù)的定量柱狀圖。圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)分析pLVX-shRNA-TFO感染后對22RV1細(xì)胞侵襲能力的影響(×400)

3 討 論

前列腺癌是威脅男性健康的常見惡性腫瘤，其全球發(fā)病率以每年5%的速度迅速增長[8]，據(jù)調(diào)查顯示，我國前列腺癌發(fā)病率比30年前增加近3倍[9]。FTO是與肥胖關(guān)系密切的易感基因[10]，而肥胖是前列腺癌等癌癥的危險(xiǎn)因素，這提示FTO可能在介導(dǎo)肥胖和腫瘤發(fā)生之間發(fā)揮作用?，F(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)TO與多種癌癥的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后存在關(guān)聯(lián)。例如，F(xiàn)TO在AML中高表達(dá)，促進(jìn)人AML細(xì)胞的存活和增殖，并抑制人AML細(xì)胞的分化和凋亡，從而促進(jìn)白血病的發(fā)生[11-12]。在雌激素受體表達(dá)陽性的子宮內(nèi)膜癌中，F(xiàn)TO可以通過PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的生長和侵襲[13]。FTO在胃癌組織中高表達(dá)的同時(shí)能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移[14]。此外，在不同癌癥中FTO表達(dá)的增加可能是由肥胖相關(guān)的FTO單核苷酸多態(tài)性引起的，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[15-17]，如，F(xiàn)TO rs9939609與前列腺癌相關(guān)。然而，關(guān)于FTO表達(dá)與前列腺癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性，目前尚缺乏相關(guān)研究。

本研究通過免疫組織化學(xué)染色在55例前列腺癌組織與52例癌旁組織中檢測了FTO的表達(dá)；且通過Western blot和qPCR實(shí)驗(yàn)在前列腺癌細(xì)胞PC3、22RV1、Du145、Lncap和前列腺正常細(xì)胞RWPE中檢測了FTO的表達(dá)。FTO在前列腺癌細(xì)胞中的mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高，與臨床病理組織中表達(dá)升高的趨勢一致，這些結(jié)果共同提示FTO的高表達(dá)可能與前列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，F(xiàn)TO高表達(dá)可能有助于前列腺癌的發(fā)生。通過結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)FTO與前列腺癌的Grade分級(jí)具有相關(guān)性。在細(xì)胞水平干擾FTO的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)降低FTO的表達(dá)可抑制前列腺癌細(xì)胞的侵襲能力，提示FTO在前列腺癌中可能具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的能力，其具體的分子機(jī)制還需在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索。

因此，本研究可為前列腺癌的治療尋找合適的靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，F(xiàn)TO可能成為前列腺癌的重要分子靶點(diǎn)。