高效液相色譜法測定兩面針藥材中2種成分含量*

馬 慶，魏偉鋒，袁煥合，許 雷，張洪勝，鄔國松，陳劍洪，韓正洲，林錦鋒△

（1.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東 深圳 518110；2.廣東省藥品檢驗所，廣東 廣州 510663；3.廣東省廣州市白云區人民醫院，廣東 廣州 510006）

兩面針Zanth oxylum nitidum（Roxb.）DC.以蔓椒之名始載于《神農本草經》［1］，列為下品，亦收載于《名醫別錄》《本草經集注》《本草圖經》《本草術原》等本草名著，別名甚多。其味苦、辛，性平，有小毒，歸肝、胃經，有活血化瘀、行氣止痛、祛風通絡、解毒消腫功效，可外用治療跌撲損傷、胃痛、牙痛、風濕痹痛、毒蛇咬傷、燒燙傷等［2］。兩面針是60余種中成藥的組方藥材之一，藥理作用廣泛，臨床應用價值較高，市場需求逐年上升。2020年版《中國藥典（一部）》收錄兩面針的藥用部位為根，對其質量要求為含氯化兩面針堿（C21H18NO4·Cl）不得少于0.13%，加之其生長年限長、產量低、可再生能力差、土地沙漠化等因素，致使其嚴重供不應求。而歷代本草、地方標準及方劑均有其不同藥用部位（包括果實、根、莖、葉）的記載，但多以根和莖入藥（見表1）。有研究證實，兩面針根部和莖的成分種類基本一致［3-4］，且藥理作用及其對應的藥效也基本相似［5-6］。兩面針藥材中的主要活性成分為氯化兩面針堿、白屈菜紅堿、8-甲氧基二氫白屈菜紅堿及橙皮苷等化合物，其中前兩種成分含量較高［3，7］。因此，本研究中擬采用高效液相色譜（HPLC）法測定上述2種成分含量，以期為兩面針藥材資源的可持續發展、合理開發利用提供參考。現報道如下。

表1 兩面針藥用部位Tab.1 Medicinal parts of Zanthox yl um nit id um

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100型高效液相色譜儀（含DAD檢測器，美國Agilent公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius公司）；UV-2550型紫外-可見分光光度計（日本Shimadzu公司）；Milli-Q超純水處理系統（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

氯化兩面針堿對照品（批號為110848-201604，含量91.0%），白屈菜紅堿對照品（批號為111718-201402，含量80.5%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。兩面針根部與莖部樣品共21批（編號1～21，相關情況見表2），經廣西壯族自治區中醫藥研究院賴茂祥研究員鑒定為正品（憑證標本存放于該研究院標本館）。

表2 樣品信息Tab.2 Information of the samples

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Thermo BETASIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（77∶23，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：273 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.2 溶液制備

稱取氯化兩面針堿對照品12.51 mg、白屈菜紅堿對照品10.78 mg，精密稱定，置20 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，即得含氯化兩面針堿569.205μg/mL、白屈菜紅堿433.895μg/mL的混合對照品溶液。取藥材樣品適量，研為粉末，取0.5 g（過二號篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入90%甲醇100 mL，稱定質量，加熱回流60 min，放冷，再稱定質量，用90%甲醇溶液補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

系統適用性試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與混合對照品溶液色譜相應位置有吸收峰。理論板數按氯化兩面針堿峰及白屈菜紅堿峰計均應不低于3 000，分離度均大于1.5，基線分離良好。詳見圖1。

線性關系考察：取2.2項下混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋，得氯化兩面針堿質量濃度分別為113.841，45.536，22.768，11.384，4.554，1.821μg/mL，白屈菜紅堿質量濃度分別為86.779，34.712，17.356，8.678，3.471，1.388μg/mL的系列混合對照品溶液。按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量為橫坐標（X，μg）、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得氯化兩面針堿回歸方程為Y1=4 112.864X1-18.523（r=0.999 9，n=5），白屈菜紅堿回歸方程為Y2=5 594.700X2-20.357（r=0.999 9，n=5）。結果表明，氯化兩面針堿、白屈菜紅堿進樣量分別在0.018 2～1.138μg和0.013 9～0.868μg范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取藥材樣品（編號為1），按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，平行測定6次，記錄峰面積。結果氯化兩面針堿、白屈菜紅堿峰面積的RSD分別為1.00%和0.80%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取2.2項下供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，16，24，48 h時，按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果氯化兩面針堿和白屈菜紅堿峰面積的R S D分別為0.30%和1.00%（n=7），表明供試品溶液室溫放置48 h內穩定。

重復性試驗：取1號樣品，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算含量。結果氯化兩面針堿和白屈菜紅堿含量的RS D分別為0.70%和2.10%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含0.168 6%（未扣除水分）氯化兩面針堿、0.138 7%（未扣除水分）白屈菜紅堿為的1號樣品共6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別精密加入一定質量濃度的混合對照品溶液，再定容至100 mL，按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取21批藥材樣品，分別按2.2項下方法制備供試品溶液，再按2.1項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以外標一點法計算含量。結果見表4。

表4 樣品含量測定結果（%）Tab.4 Results of content determination of nitidine chloride and chelerythrine in the samples（%）

可見，21批藥材樣品中氯化兩面針堿和白屈菜紅堿總含量為0.068%～0.395%，平均0.219%，因各批次間的測定結果較分散，以該值下調30%，即得含量為0.153%。故建議，規定本品含氯化兩面針堿和白屈菜紅堿的總含量不得少于0.150%。在該條件下，21批藥材樣品中有6批不符合規定。

3 討論

3.1 檢測波長選擇

預試驗中，分別在200～500 nm紫外波長范圍內對氯化兩面針堿對照品溶液、白屈菜紅堿對照品溶液和混合對照品溶液進行掃描，結果分別在272，282，273 nm波長處有最大吸收峰。因本研究需同時測定此兩種成分含量，故確定紫外檢測波長為273 nm。

3.2 色譜柱和流動相選擇

預試驗中，以含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（78∶22，V/V）為流動相，比較了Thermo公司BETASIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）和BDS HYPERSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），結果前者峰形較好，而后者色譜峰拖尾較嚴重，故采用前者作為本研究的色譜柱。還比較了（A）0.1%甲酸（用三乙胺調pH至4.5）-乙腈（75∶25，V/V）、（B）含0.2%三乙胺的0.3%磷酸溶液-乙腈（77∶23，V/V）、（C）1 mmol/L庚烷磺酸鈉（用3 mol/L磷酸調pH至2.6）-乙腈（70∶30，V/V）3種流動相，結果以流動相（B）峰形最好。

3.3 提取方式考察

預試驗中，考察了2種提取方式（超聲提取、加熱回流），并在此基礎上采用3因素、3水平的正交試驗考察提取溶劑（50%，70%，90%甲醇）、提取時間（30，60，90 min）、溶液用量（25，50，100 mL）對提取效果的影響。結果表明，加熱回流提取效果略優于超聲提取，故選擇加熱回流提取；對提取得率的影響從大到小為甲醇體積分數＞溶劑體積＞提取時間，故最佳的提取條件以90%甲醇100 mL為溶劑，提取60 min。由此制備的供試品溶液色譜峰數目最多，峰面積較大，峰形較好。

3.4 方法評價

兩面針含較多種化學成分，目前標準中的薄層色譜鑒別和含量測定項目僅針對其個別成分，不能綜合反映兩面針藥材中各主要成分含量。因此，本研究中利用HPLC法對氯化兩面針堿和白屈菜紅堿進行定量分析。本方法重復性好，可操作性強，可用于兩面針藥材整體化學質量的一致性評價。

藥材樣品中氯化兩面針堿和白屈菜紅堿總含量（以下簡稱總含量）最高的是20號（越南-2），最低為14號（廣東高州市鎮江鎮）。在栽培的藥材樣品中，同樣為5年生栽培樣品，2號（廣西大新縣福隆鄉）總含量明顯高于1號（廣東電白區麻崗鎮），且廣東藥材樣品指標性成分含量普遍低于廣西藥材樣品。就本研究中建議總含量不得少于0.150%的結果而言，廣西更適合兩面針的種植，且種植時間為5～6年，該結果在一定程度佐證了廣西為兩面針的道地產區，同時也為兩面針的采收時間提供了一定參考。由于本研究中收集的21批藥材采收時期、生長年份不同，同時也受到地域水土、氣候等因素影響，可能導致藥材化學成分含量差異較大，后續將會收集更多的藥材樣品對本研究進行深入分析。

綜上所述，本研究中對不同來源（栽培、野生、藥材市場）21批兩面針藥材樣品（莖、根）進行含量測定，并制訂了氯化兩面針堿和白屈菜紅堿總含量限度，可有效評價兩面針根及莖的質量，為兩面針資源的可持續發展及合理開發利用奠定基礎。