三子固本方多糖提取純化及其免疫活性初步研究*

歐立娟，黃愛華，于 洋，王 青

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006）

三子固本方（SZGB）由金櫻子、絞股藍(lán)、余甘子、五味子4味中藥組方，臨床用于治療糖尿病腎?。―N），在改善腎組織病變方面效果較好。三子固本方多糖（SRP）是SZGB經(jīng)水提醇沉制備而得，有研究顯示，SRP可減緩核因子（NF）-κB介導(dǎo)的模型小鼠DN的進(jìn)展［1］。三子固本顆粒對(duì)DN模型大鼠具有抗氧化應(yīng)激和抑制腎間質(zhì)纖維化的作用［2］。DN模型大鼠機(jī)體除了存在不同程度的微炎癥、氧化應(yīng)激、組織增生及纖維化等，還存在免疫功能低下狀況［3］，提示調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能可能有利于改善DN?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，絞股藍(lán)、金櫻子、五味子及其多糖部位均有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、調(diào)血脂等作用，余甘子具有增強(qiáng)免疫、抗氧化、調(diào)節(jié)糖代謝及脂代謝等作用［4-8］，提示SZGB可能具有免疫調(diào)節(jié)作用，多糖可能是其主要的物質(zhì)基礎(chǔ)。鑒于此，本研究中優(yōu)化了SRP的提取工藝，對(duì)SRP進(jìn)行初步分離純化，同時(shí)觀察了SRP對(duì)DN模型小鼠免疫功能的影響，旨在為闡明SRP治療DN的作用機(jī)制提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料

儀器：DKN612C型鼓風(fēng)干燥箱、CF311C型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Yamato公司）；722s型紫外-可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q型蒸餾水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；TG16-WS型高速離心機(jī)（上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；CBS-B型程控多功能全自動(dòng)部分收集器、DHL-N型電腦數(shù)顯定時(shí)恒流泵（上海滬西分析儀器廠有限公司）；MCO175型二氧化碳培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；CX31型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；M200型多功能酶標(biāo)儀（瑞典Tecan公司）；FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

試藥：葡萄糖對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為110833-201707，含量99.90%）；注射用環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批號(hào)為18091821）；中綿羊紅細(xì)胞（SRBC，新鮮綿羊全血購(gòu)自廣州石馬實(shí)驗(yàn)場(chǎng)）；RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)為31800-014）；胎牛血清（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)為NSK0069）；羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（CAS No.7365-45-9）、刀豆凝集素A（ConA，CAS No.11028-71-0），均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑（CCK-8）盒（日本Dojindo公司，批號(hào)為WF856）；DEAE-52纖維素柱（批號(hào)為HA-0820）、Sephadex G-100凝膠柱（北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司，批號(hào)為HA-0260）；中華墨汁（北京一得閣工貿(mào)集團(tuán)）；水為蒸餾水。金櫻子（批號(hào)為20190303）、絞股藍(lán)（批號(hào)為20190404）、五味子（批號(hào)為20190312）、余甘子（批號(hào)為20190310）藥材飲片，均購(gòu)自廣州市藥材公司中藥飲片廠。

動(dòng)物：SPF級(jí)NIH系小鼠200只，體質(zhì)量18～22 g，雌雄各半，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（粵）2019-0047。飼養(yǎng)環(huán)境溫度25℃，相對(duì)濕度60%。實(shí)驗(yàn)符合中國(guó)動(dòng)物福利法，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理和使用委員會(huì)批準(zhǔn)。

細(xì)胞：YAC-1細(xì)胞，購(gòu)自中山大學(xué)細(xì)胞中心。

2 方法與結(jié)果

2.1 SRP提取工藝優(yōu)化

2.1.1 總多糖含量測(cè)定

顯色條件：取葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL容量瓶，以水溶解，依次加入1.2 mL 5%苯酚溶液、6 mL濃硫酸，定容，30℃恒溫水浴30 min，取出，冷卻至室溫［9］。

溶液制備：稱取葡萄糖對(duì)照品51.60 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水定容，即得質(zhì)量濃度為1.032 mg/mL的對(duì)照品溶液。將SZGB中4味藥材飲片分別打粉過篩，按復(fù)方比例混勻，加入一定體積的水，煎煮浸提，濾過，即得供試品溶液。

方法學(xué)考察：1）線性關(guān)系考察，精密量取“溶液制備”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0，1，2，2.5，4，5 mL，分別置10 mL容量瓶中，加水定容，搖勻，制成系列對(duì)照品溶液。按“顯色條件”項(xiàng)下方法制成質(zhì)量濃度為0，10.32，20.64，25.80，41.28，51.60μg/mL的系列待測(cè)溶液，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（O D）［9］。以葡萄糖質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、吸光度（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.245X-0.023 8（R2=0.997）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在0～51.60μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。2）按2020年版《中國(guó)藥典（一部）》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收試驗(yàn)，結(jié)果葡萄糖吸光度的R SD分別為0.26%（n=6）、1.19%（n=6）、1.98%（n=6），表明儀器精密度良好，供試品溶液在室溫放置5 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好，平均加樣回收率為99.10%，RSD為2.46%（n=6）。

2.1.2 正交試驗(yàn)

以提取時(shí)間（因素A）、提取次數(shù)（因素B）、料液比（因素C）為考察因素，以總多糖含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)法優(yōu)選SRP的最佳提取工藝［10］。因素水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。由表2及表3可知，各因素作用強(qiáng)弱依次為B＞A＞C。根據(jù)實(shí)際情況綜合考慮，確定SRP最佳提取工藝是A3B2C3，即提取2次、料液比1∶20、每次提取2.5 h。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA

2.1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

按處方比例稱量復(fù)方藥材3份，采用優(yōu)化提取條件進(jìn)行工藝驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總多糖平均含量為105.32 mg/g（得率0.98%），RS D為3.07%（n=3）?？偠嗵呛拷咏辉囼?yàn)表中的最高值，且重復(fù)性好，工藝穩(wěn)定合理。

2.2 SRP制備

取4種藥材飲片粉末（過50目篩），混合均勻，石油醚浸泡24 h，脫脂后干燥。按最佳工藝煎煮，合并續(xù)濾液，80℃及60 r/min條件下濃縮至原有體積的1/4，與95%乙醇（1∶4，m/V）混勻，4℃放置24 h，常規(guī)離心，去除上清液，得褐色沉淀物，60℃干燥，即得SRP［11］。

2.3 SRP分離純化［12］

DEAE-52纖維素柱：采用Sevage法除蛋白后，取適量的SRP，加水，充分溶解制成1.0 mg/mL的SRP溶液，緩慢加到已平衡好的DEAE-52纖維素柱中，依次用蒸餾水及0.1，0.3，0.5 mol/mL的NaCl溶液洗脫，每梯度20管，每管10 min，流速為1.0 mL/min。全自動(dòng)部分收集器收集洗脫液，以苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、收集管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。結(jié)果DEAE-52纖維素柱對(duì)SRP具有明顯的分離效果，分別在水及0.1，0.3 mol/mL NaCl溶液處分離出多糖成分，收集各洗脫峰部分命名為A，B，C，60℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。洗脫曲線見圖2。

Sephadex G-100凝膠柱：取上述A，B，C收集液5 mL，分別加到已平衡好的Sephadex G-100凝膠柱中，以流速為0.1 mL/min的水洗脫，每管10 min，收集各洗脫液，以苯酚-硫酸法在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、收集管數(shù)為橫坐標(biāo)繪制洗脫曲線。結(jié)果成分A無(wú)法分離，洗脫條件有待進(jìn)一步優(yōu)化；成分B為單一峰，且峰形相對(duì)對(duì)稱，表明B為單一成分，有待確定其結(jié)構(gòu)；成分C有2個(gè)分子量較集中的組分構(gòu)成，有待進(jìn)一步分離。洗脫曲線見圖3。

2.4 小鼠免疫功能影響實(shí)驗(yàn)

2.4.1 小鼠溶血素生成實(shí)驗(yàn)及臟器指數(shù)測(cè)定

將50只NIH小鼠分為正常對(duì)照組（等體積水）、模型組（等體積水）、三子固本方原液（SZGB）組（4 700 mg/kg）及SRP低、高劑量組（SZGB組，1 010，2 020 mg/kg），各10只。灌胃給藥或水，每日1次，連續(xù)15 d。給藥第12天時(shí)，腹腔注射環(huán)磷酰胺（120 mg/kg）以復(fù)制免疫功能低下小鼠模型，同時(shí)腹腔注射5%SRBC致敏。末次給藥后第1天，取全血上清液，加入有2.5%SRBC、1∶10豚鼠補(bǔ)體的試管中，混勻，為待測(cè)樣品；以生理鹽水為空白樣品。各樣品37℃水浴40 min，后置冰水中10 min終止反應(yīng)。2 000 r/min離心10 min，取上清液200μL，以空白樣品調(diào)零，以酶標(biāo)儀在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定待測(cè)樣品吸光度［13］，以該值表示溶血素生成量。同時(shí)取小鼠胸腺、脾臟稱定濕質(zhì)量（mg），除以對(duì)應(yīng)小鼠的體質(zhì)量再乘以10，即得脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。與正常對(duì)照組比較，模型組溶血素生成量、胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)均顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，SZGB組及SRP低、高劑量組溶血素生成量顯著增加（P＜0.05）。詳見表4。

表4 各組溶血素生成量及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of hemolysin production，thymus index and spleen index in each group（±s，n=10）

表4 各組溶血素生成量及胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of hemolysin production，thymus index and spleen index in each group（±s，n=10）

注：與正常對(duì)照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。表5同。Note：Compared with those in the normal control group，#P＜0.05，##P＜0.01；Compared with those in the model group，*P＜0.05，**P＜0.01（for Tab.4-5）.

組別正常對(duì)照組模型組SZGB組SRP低劑量組SRP高劑量組吸光度1.599 9±0.257 8 0.096 0±0.011 4##0.107 0±0.004 5*0.107 5±0.005 0**0.108 6±0.006 2**胸腺指數(shù)17.99±5.35 12.03±3.58##10.88±3.62 10.84±3.31 10.68±3.14脾臟指數(shù)55.72±9.93 29.16±5.80##28.80±6.90 26.47±3.57 29.46±8.47

2.4.2 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

同2.4.1項(xiàng)下方法分組及給藥。末次給藥后第1天，尾靜脈注射稀釋墨汁，分別于注射后2，20 min眼眶后靜脈叢取血20μL，脫頸椎處死小鼠，取其肝臟和脾臟立即稱質(zhì)量（濕質(zhì)量）。以酶標(biāo)儀在570 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，按下式計(jì)算廓清指數(shù)（K）和校正廓清指數(shù)（α），以α表示碳廓清能力。與正常對(duì)照組比較，模型組α顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SZGB組及SRP低、高劑量組α顯著升高（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組α、NK細(xì)胞殺傷活性、SI比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of ofα，killing activity of NK cells and SI in each group（±s，n=10）

表5 各組α、NK細(xì)胞殺傷活性、SI比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of ofα，killing activity of NK cells and SI in each group（±s，n=10）

組別正常對(duì)照組模型組SZGB組SRP低劑量組SRP高劑量組α 3.53±0.37 3.11±0.46#3.43±0.15*3.70±0.27*3.72±0.40*NK細(xì)胞殺傷活性（%）20.10±2.59 15.47±1.38#17.17±0.96*18.95±2.71*19.05±2.42**SI 2.02±0.85 1.04±0.28#1.37±0.30 1.63±0.73 1.81±0.74*

O D1為t1（2 min）血樣本的O D值，OD2為t2（20 min）血樣本的O D值。

2.4.3 小鼠NK細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)

取傳代1 d生長(zhǎng)的YAC-1細(xì)胞，以磷酸鹽緩沖液（PBS）調(diào)細(xì)胞密度至2×106mL-1，加入終濃度為1μmol/L的熒光染料CFSE，混勻后染色10 min，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞密度至1×105mL-1。實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組、模型組、SZGB組及SRP低、高劑量組。取效應(yīng)細(xì)胞（小鼠脾細(xì)胞）及靶細(xì)胞（YAC-1細(xì)胞）各100μL，加入96孔U底板內(nèi)（效靶比例為50∶1）。37℃下孵育約4 h，收集細(xì)胞置5 mL離心管中，加1 mL PBS，1 200 r/min離心10 min。棄上清液，用400μL PBS重懸細(xì)胞，加20μL PI溶液，染色5 min，以流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。以CFSE和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞為死亡靶細(xì)胞，按公式［NK殺傷活性（%）=（實(shí)驗(yàn)組死亡率-正常對(duì)照組死亡率）/（100%-正常對(duì)照組死亡率）×100%］計(jì)算NK細(xì)胞殺傷活性（正常對(duì)照組死亡率是指未加入效應(yīng)細(xì)胞時(shí)，YAC-1細(xì)胞自發(fā)死亡率）。與正常對(duì)照組比較，模型組NK細(xì)胞殺傷活性顯著減弱（P＜0.05）；與模型組比較，SZGB組及SRP低、高劑量組NK細(xì)胞殺傷活性顯著增強(qiáng)（P＜0.05）。詳見表5。

2.4.4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)［14-15］

同2.4.1項(xiàng)下方法分組及給藥。末次給藥后第1天，頸椎脫臼處死小鼠，無(wú)菌取其脾臟，常規(guī)制備脾細(xì)胞懸液，1 200 r/min離心10 min，收集細(xì)胞，用消毒超純水溶解紅細(xì)胞，以等量1.8%高滲氯化鈉溶液恢復(fù)其等滲狀態(tài)。裂解紅細(xì)胞后，洗滌淋巴細(xì)胞2次，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)細(xì)胞數(shù)至2×106mL-1，細(xì)胞培養(yǎng)板每孔加入0.2 mL細(xì)胞懸液及0.01 mL ConA，以未加ConA的孔作對(duì)照，以RPMI 1640培養(yǎng)液作空白對(duì)照，各組均采用3個(gè)復(fù)孔。5%CO2、37℃、飽和濕度下培養(yǎng)72 h，于培養(yǎng)結(jié)束前1 h，每孔小心吸棄100μL培養(yǎng)液上清液，加入CCK-8，每孔0.01 mL。以酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，刺激指數(shù)（SI）=（ConA孔吸光度-空白對(duì)照組吸光度）/（對(duì)照孔吸光度-空白對(duì)照組吸光度）。與正常對(duì)照組比較，模型組SI顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，SRP高劑量組SI顯著升高（P＜0.05）。詳見表5。

3 討論

本研究中將SZGB中的多糖提取出來單獨(dú)用藥具有如下優(yōu)點(diǎn)：1）可解決患者服藥量大的問題，避免煎煮中藥的不便；2）SRP制備后，可在一定程度上增強(qiáng)藥效；3）SRP制備過程及質(zhì)量控制的建立，可一定程度解決中藥復(fù)方質(zhì)量難把控的難題。SRP是由SZGB經(jīng)熱水浸提制備得到。在制備過程中，參考了文獻(xiàn)報(bào)道的水提醇沉法，發(fā)現(xiàn)多糖經(jīng)過凍干機(jī)冷凍干燥后得到的成品比60℃干燥后得到的多糖成品具有更強(qiáng)的吸濕性，故本研究中SRP未作凍干處理，均采用60℃干燥法。

本研究中SRP采用Sevage法除蛋白，同時(shí)比較了多糖損失和蛋白清除率的變化。結(jié)果除蛋白后SRP純度較高，但損失率超過34.1%，總量較少，這是制約純化多糖應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的主要因素。因此，本研究中采用未除蛋白的SRP用于小鼠免疫功能方面的研究。

機(jī)體的免疫功能包括體液免疫、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞活性和細(xì)胞免疫4個(gè)方面［16-17］。本研究中分別通過溶血素生成（體液免疫）、小鼠碳廓清能力（單核-巨噬細(xì)胞功能）、NK細(xì)胞殺傷活性和脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)（T細(xì)胞免疫功能），探討SRP對(duì)免疫功能低下模型小鼠的影響。結(jié)果顯示，SZGB和SRP均能不同程度提升模型小鼠的免疫功能。在體液免疫方面效果尤其顯著，提示在各給藥組的溶血素水平均顯著升高，表明提高B細(xì)胞免疫功能可能是其增強(qiáng)機(jī)體免疫力的主要途徑之一；但ConA刺激的小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中僅有SRP高劑量組的變化具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示在細(xì)胞免疫方面作用可能較弱；單核-巨噬細(xì)胞功能和NK細(xì)胞活性方面均有較好的改善效果；SRP比SZGB對(duì)小鼠免疫功能具有更好的改善作用。

綜上所述，提取工藝的優(yōu)化在一定程度上提高了SRP的提取率，分離純化為SRP進(jìn)一步的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定了基礎(chǔ)。本研究中雖證實(shí)了SRP具有增強(qiáng)模型小鼠免疫功能的作用，但在免疫機(jī)制方面的研究較淺，如通過何種有效成分來調(diào)節(jié)，以及調(diào)節(jié)免疫活性的途徑等尚未清晰，仍需進(jìn)一步研究。