白藜蘆醇調控hsa-miR-4689-3p、hsa-miR-4741-3p保護腎小球系膜細胞

張 銘，于昕新，浦葒秋，田 陽，韓鎧禧，趙天月，梁競天，楊 果，閔鈺淇，石 艷

(吉林大學藥學院，吉林 長春130021)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發癥，腎小球系膜細胞(mesangial cells，MCs)是DN極其重要的靶細胞。MicroRNA(miRNA)是人體中普遍存在的重要調節因子。研究表明，miRNA對腎小球系膜細胞的肥大具有調節作用[1-3]，miRNA可以作為DN早期檢測和進展的生物標志物[4]。miRNA通過靶向其各自的靶標來調節與纖維化相關的基因的表達，從而影響了DN中腎纖維化的進程[5]。白藜蘆醇是天然具有抗氧化作用的多酚類物質，可抑制腎小球系膜細胞增殖[6]，改善腎臟組織當中的脂毒性、內皮功能障礙、細胞凋亡以及氧化應激等[7]，具有降血糖作用[8]，但其對高糖下的MCs中miRNA的影響目前尚不明確。我們前期研究采用miRNA芯片技術篩選出腎小球系膜細胞正常組，高糖組和白藜蘆醇藥物干預組這三組特異性差異表達的MicroRNA。本研究擬結合文獻和前期結果，選擇hsa-miR-4689-3p、hsa-miR-4741-3p作為研究對象，采用real-time PCR技術檢測其在各組腎小球系膜細胞中的相對表達量，通過生物信息學軟件預測靶基因，探討白藜蘆醇對高糖下腎小球系膜細胞的保護作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器DMEM高糖培養基(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，胎牛血清(天津灝洋生物制品有限公司，中國)，白藜蘆醇(南京景竹生物科技有限公司，中國)，TransScript 反轉錄反應體系One-Step gDNA Removal (北京全式金生物技術有限公司，中國)，通用RNA提取試劑盒(離心柱型)(廣州東盛生物科技有限公司，中國)，hsa-miR-4689(廣州易錦生物技術有限公司，中國)，hsa-miR-4741(廣州易錦生物技術有限公司，中國)。Stratagene實時熒光定量PCR儀(美國安捷倫公司，美國)。

1.2 MCs的復蘇，培養、傳代及分組水浴融化HMCs細胞并滴加10 ml的DMEM低糖培養液(10%胎牛血清)。離心，棄上清，10 ml完整營養物質的培養液吹散細胞，計數、調整密度后接種于培養瓶中。置于培養箱(37°C，5%CO2)中培養，隔天更換培養基，PBS洗兩次，每個培養基補充至8 ml，置于培養箱中繼續培養。將腎小球系膜細胞分為空白對照組(Con)，高糖組(HG)和白藜蘆醇組(Res)。

1.3 real-time PCR檢測差異表達的microRNATrizol提取MCs的total RNA。MicroRNA以加尾法進行逆轉錄得到有更高長度的逆轉錄產物cDNA來進行下一步中PCR擴增。按照TransScript miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix說明書操作，用2-△△CT法測定相對表達量。

1.4 靶基因預測采用MiRanda與TargetScan兩個數據庫對差異microRNA進行靶基因預測。

1.5 統計學處理SPSS19.0 軟件分析統計數據，所有數據用平均數±標準差表示，組間差異用方差分析進行統計學檢驗，組間兩兩比較采用最小顯著差法。P<0.05 為差異具有統計學意義，P<0.01 為差異具有顯著性統計學意義。

2 結果

2.1 real-time PCR檢測差異表達microRNA與Con組相比，HG組中的hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的相對表達量明顯降低。與HG組相比，Res組人腎小球系膜細胞中的hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的相對表達量明顯升高，其結果與本研究前期microRNA芯片一致，結果見圖1。

圖1 hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的相對表達量

2.2 microRNA的靶基因預測結合前期microRNA芯片與real-time PCR的實驗結果，對hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p進行靶基因預測。MiRanda與TargetScan兩個數據庫兩個microRNA靶基因預測數據庫得到的靶基因取交集之后，發現hsa-miR-4689有OPA3,HCN4,HPSE等75個靶基因，其中與DN密切相關的靶基因有FASN、PAX2、PTPN5、ANGPT2等，hsa-miR-4741有CILP2,MMAB,POR等53個靶基因，其中與DN密切相關的靶基因有CD4、PLVAP、GAS2L1、SMURF1、KDM4B、SERPINA3、CACNA1C、DDR1等,如表2所示。

表2 hsa-miR-4689-3p和hsa-miR-4741-3p與DN密切相關靶基因

2.3 GO功能富集分析結果

對 hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p靶基因進行GO功能富集分析，發現hsa-miR-4689-3p的靶基因與細胞外基質組織功能、細胞增殖負調控、離子跨膜運輸、蛋白質結合、T細胞激活、脂質分解、膜電位調節、血管生成、氯離子通道調節等生物學功能密切相關；hsa-miR-4741-3p的靶基因與細胞外基質組織功能、酶結合、蛋白激酶結合、響應鉀離子等生物學功能密切相關。

3 討論

目前已有研究表明白藜蘆醇基于其抗氧化應激、抗自噬和抗炎癥等效果對DN有一定的防治效果，且對相關microRNA具有一定的調節作用[10-13]。我們的前期研究發現：高糖環境培養MCs可誘導其異常增殖，白藜蘆醇對高糖下MCs有顯著的抑制作用，能夠改善高糖引起的MCs過度增殖。

microRNA的發現為糖尿病腎病機制的研究與防治方法的探尋帶來了新思路。本研究從microRNA表達水平的角度，探討白藜蘆醇對MCs的保護作用的可能機制，為其更好的用于治療DN提供良好的理論基礎。本研究中，real-time PCR的結果顯示，經白藜蘆醇處理的高糖條件下MCs中hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的表達水平顯著上調，而兩者在HG組中呈現低表達。這與我們前期的芯片結果一致，我們推測白藜蘆醇可能通過調節hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p的表達起到對MCs的保護作用。

靶基因預測結果發現hsa-miR-4689有OPA3,HCN4,HPSE等75個靶基因，hsa-miR-4741有CILP2,MMAB,POR等53個靶基因，功能涉及范圍十分廣泛，包括細胞增殖，分化，血管生成，信號轉導等許多方面。其中hsa-miR-4689的靶基因FASN已被驗證在DN的小鼠腎臟中異常上調，并且FASN的高表達可通過導致腎小球硬化來加重糖尿病腎損傷[14]； PTPN5被檢測到在糖尿病小鼠的腎組織中高表達，且利用刺參酶解物下調PTPN5后，顯示出較好的降糖效果[15]；ANGPT2 可在高糖下協同誘導系膜細胞凋亡，且通過抑制miR-33-5p來啟動凋亡程序[16]。hsa-miR-4741的靶基因CD4編碼 T 淋巴細胞的 CD4 膜糖蛋白，DN下血清中CD4的表達異常下調，從而導致DN患者免疫功能低下[17]；PLVAP 是一種完整的跨膜糖蛋白，其在正常小鼠的腎小球中表達呈陰性，但隨著糖尿病腎小球病變程度的加深，PLVAP的表達逐漸上調，表明PLVAP 可作為糖尿病腎小球病變的潛在標志物[18]； SMURF1是Smad 泛素化調節因子-1，在高糖誘導的腎小球系膜細胞中表達增加，并可通過抑制Nrf2/ARE 信號通路的激活誘導糖尿病腎衰竭的發生與發展[19]； DDR1 是一種膠原蛋白受體，可與Ⅳ型膠原蛋白結合，并且在腎臟中高度表達，尤其是在腎損傷時,通過其在膠原蛋白結合中的作用，DDR1已被建議作為腎臟疾病的可能治療靶點[20]。

綜上所述，本研究表明白藜蘆醇對高糖下MCs的多種microRNA有調控作用；每一個microRNA都對應著多個靶基因。白藜蘆醇對高糖下MCs的保護作用可能部分通過調節hsa-miR-4689-3p與hsa-miR-4741-3p實現。對于hsa-miR-4689-3p和hsa-miR-4741-3p與DN密切相關的靶基因及相關信號通路將是我們進一步研究的課題。