高黏液性肺炎克雷伯菌的臨床特征及分子分型

王英英，武彬蔚，李 莉*

(1.青島市中醫(yī)醫(yī)院(市海慈醫(yī)院) 輸血科，山東 青島266033；2.青島市市立醫(yī)院 檢驗(yàn)科，山東 青島266011)

肺炎克雷伯菌(KP)是醫(yī)院內(nèi)常見的條件致病菌，依據(jù)其黏液性可將KP分為經(jīng)典的KP(cKP)和高黏液性KP(hvKP)。hvKP可引起肝膿腫、肺炎、菌血癥、腦膜炎等多種疾病，其致死率達(dá)3%-32%[1-2]。近年來，hvKP的分離率有逐年增高的趨勢，可高達(dá)30%-50%[3]。由于hvKP的高分離率和致死率，已成為全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域關(guān)注的焦點(diǎn)。本研究對臨床分離的hvKP的標(biāo)本來源、臨床分布以及毒力基因的攜帶情況進(jìn)行總結(jié)分析，旨在為臨床因hvKP引起的感染的診治及防控提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源收集 2019年1月-2020年12月，青島市中醫(yī)醫(yī)院住院患者各種感染性標(biāo)本中分離的KP 631株。細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)采用VITEK 2-compact全自動細(xì)菌鑒定/藥敏系統(tǒng)進(jìn)行測定，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922和肺炎克雷伯菌ATCC 700603。分離到的KP通過拉絲試驗(yàn)進(jìn)行分類，即使用接種環(huán)在分離KP的血瓊脂平板上，向上挑起單個菌落，若有黏液絲形成且長度≥5 mm，則判定為陽性，若無黏液絲形成或其長度<5 mm，則為陰性。將篩選的hvKP存于-80℃低溫冰箱備用。

1.2 毒力基因及莢膜血清型檢測用煮沸法提取待檢菌株的DNA，采用PCR方法參照文獻(xiàn)[4]檢測6種毒力基因(magA、rmpA、rmpA2、kfu、iroNB、aerobactin)及常見的莢膜血清型(K1、K2、K5、K20、K54、K57)。

1.3 多位點(diǎn)序列分型選取KP的7個管家基因，管家基因引物序列由MLST網(wǎng)站提供(肺炎克雷伯菌：http://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html)，通過PCR擴(kuò)增7個管家基因，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序并于網(wǎng)站比對，可根據(jù)各管家基因亞型即可最終得到MLST分型。管家基因引物序列見表1，PCR反應(yīng)體系見表2。

表1 肺炎克雷伯菌管家基因引物序列及相關(guān)信息

表2 MLST管家基因PCR 反應(yīng)體系

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用WHONET 5.6軟件進(jìn)行細(xì)菌及藥敏統(tǒng)計(jì)，藥敏結(jié)果比較采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 hvKP的檢出率在631株KP中共檢出hvKP 56株，檢出率為8.9%。

2.2 hvKP的標(biāo)本來源和臨床分布56株hvKP的標(biāo)本來源為：穿刺液17株(30.4%)、血液12株(21.4%)、膿液11株(19.6%)、痰液6株(10.7%)、尿液3株(5.4%)，其他標(biāo)本7株(12.5%)。其科室分布為：急診病房12株(21.4%)、肝膽外科病房8株(14.3%)、呼吸科病房7株(12.5%)、普外科病房6株(10.7%)、神經(jīng)外科病房5株(8.9%)、神經(jīng)內(nèi)科病房5株(8.9%)、內(nèi)分泌科病房5株(8.9%)，其他病房8株(14.3%)。

2.3 藥敏結(jié)果hvKP對大多數(shù)臨床常用抗菌藥物具有較高的敏感性，其耐藥率明顯低于cKP，見表3。

表3 hvKP和cKP對臨床常用抗菌藥物的耐藥率(%)

2.4 莢膜血清型及毒力基因檢測結(jié)果56株hvKP共檢出K1型23株、K2型16株、K5型4株、K57型6株、K54型5株，分別占41.1%、28.6%、7.1%、10.7%和8.9%，未檢出K20型，還有2株未分型。毒力基因主要以aerobactin和rmpA的攜帶率最高，分別為87.5%和78.6%，rmpA2、iiroNB、kfu和magA的攜帶率分別為58.9%、48.2%、39.3%和10.7%。

2.5 MLST分型結(jié)果MLST分型的主要流行株是ST23，占25.0%，其次為ST86、ST11、S651，分別占12.5%、10.7%和8.9%，其他型別均小于5%。

2.6 hvKP管家基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖1。

圖1 肺炎克雷伯菌管家基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

3 討論

自1986年在我國臺灣省首先發(fā)現(xiàn)1例hvKP以來[5]，相繼在很多國家和地區(qū)對hvKP所引起的感染性疾病進(jìn)行研究和報(bào)道，hvKP不僅可導(dǎo)致免疫力低下人群的感染，甚至還會引起健康人群全身多個部位的感染，其檢出率和致死率均較高。本研究在631株KP中檢出hvKP 56株，檢出率為8.9%，與孫凱莉報(bào)道的[6]9.62%較一致，但明顯低于其他地區(qū)[2,7]。有研究表明hvKP的檢出率不同地區(qū)之間差異較大8.3%-73.9%[7]，hvKP的標(biāo)本來源和臨床分布在不同的地區(qū)不同的醫(yī)院內(nèi)有所不同，本研究結(jié)果表明hvKP主要來自于急診病房和肝膽外科病房，穿刺液、血液和膿液為hvKP的主要標(biāo)本來源，與其他地區(qū)[1,6]存在差異。因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)做好檢測，總結(jié)本地區(qū)本單位的流行病學(xué)資料，給臨床和感控部門提供依據(jù)。

KP菌體表面覆著大量的莢膜多糖，被認(rèn)為是KP最重要的毒力因子，其中K1、K2、K5、K20、K54、K57與hvKP相關(guān)性最高。本研究共檢出5種血清型，以K1和K2型為主，主要攜帶aerobactin和rmpA基因，與文獻(xiàn)[8]較一致，而與胡久麗[9]報(bào)道的來源于痰液標(biāo)本所占比例略有差異，由此可見不同的標(biāo)本來源所分離的hvKP其所攜帶的莢膜多糖類型也可不同。本研究的56株hvKP在MLST分型中，以ST23和ST86為主。研究表明，ST23是hvKP中最常見的序列型[9]，并且與K1血清型密切相關(guān)，本研究結(jié)果與之相符。

藥敏結(jié)果顯示，hvKP對臨床常用的抗菌藥物具有較高的敏感性，其耐藥率明顯低于cKP。盡管hvKP對臨床常用的抗菌藥物的敏感性較高，但是因其具有高毒力性和侵襲性，所導(dǎo)致的感染在臨床上的治療效果不佳，并且近年來，我國多個地區(qū)報(bào)道分離出耐碳青霉烯類高黏液性KP(CR-hvKP)，有學(xué)者[10]在56個多中心醫(yī)院中的研究發(fā)現(xiàn)，在1052株CRKP中分離出CR-hvKP 55株，其分離率達(dá)到了5.2%，因CR-hvKP具有高侵襲性、高毒力性和高耐藥性等特點(diǎn)，給臨床抗感染治療帶來了極大困難。KP具有多種生物學(xué)表型[11]，不同地區(qū)、不同醫(yī)院其分離率和臨床分布均可不同，并且不同的生物學(xué)表型其臨床治療和預(yù)后也存在較大差異，因此，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)與臨床通力協(xié)作，明確KP的流行病學(xué)特征，針對不同的生物學(xué)表型制定相應(yīng)的治療方案，提高抗感染的治療效果。