LncRNA H19和VEGF-b在糖尿病視網膜病變患者中的表達及臨床意義

唐曉蕾，代 艷，丁 倩，李 倩，蔣 艷，李 建

(1.綿陽市中心醫院 眼科，四川 綿陽621000；2.巴中市通江縣醫院 眼科，四川 巴中635700)

糖尿病視網膜病變(DR)是糖尿病患者最常見的微血管并發癥之一，已成為全球重要的公共衛生和經濟問題[1]。其發病機制復雜，至今尚不明確。有研究表明，新血管形成可引起視網膜靜脈阻塞和糖尿病性視網膜病等多種病理過程[3]。VEGF-b屬于血管內皮生長因子家族成員，在病理組織中的蓄積會損害胰島素信號傳導，導致胰島素抵抗和代謝功能障礙，并導致2型糖尿病[4]。VEGF-b通過控制內皮脂肪酸轉運蛋白的表達來調節脂質通過血管內皮運輸到組織細胞的過程，即下調該途徑調節內皮細胞長鏈脂肪酸的攝取，引起脈絡膜和視網膜新血管的形成，很多研究認為該作用可能與糖尿病性視網膜病變具有相關性[5-6]，但具體機制仍需要明確。長鏈非編碼 RNA(LncRNA)在基因轉錄和蛋白質降解的直接調節以及細胞器生物發生和亞細胞運輸等功能中具有重要作用[7]。研究表明，LncRNA與糖尿病等其他疾病的發生發展有關[8]，Thomas AA等研究表明LncRNA H19可通過Smad非依賴性機制涉及TGF-β調節糖尿病視網膜病變中的內皮-間質轉化[9]。本研究探究了LncRNA H19和VEGF-b在糖尿病視網膜病變患者玻璃體和血清中的表達水平，并分析了這兩個因子是否為糖尿病視網膜病變的危險因子，結果如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取于2017年5月-2019年6月期間就診于綿陽市中心醫院的2型糖尿病患者120例為研究對象，2型糖尿病診斷標準參考中國2型糖尿病防治指南(2010 版)[10]和2014年我國糖尿病視網膜病變臨床診療指南[11]，根據眼底鏡和眼底熒光血管造影檢查結果將研究對象分為糖尿病無視網膜病變組(DM組，男19例，女21例)、非增殖型糖尿病視網膜病變組(NPDR組，男20例，女20例)和增殖型糖尿病視網膜病變組(PDR組，男20例，女20例)3組，每組各40例患者(40眼)。另選特發性黃斑裂孔且不伴糖尿病的患者40例(40眼)做對照組(NC組)，四組患者在年齡和性別方面差異無統計學意義(P>0.05)，DM組、NPDR組和PDR組患者在糖尿病病程、空腹血糖水平及糖化血紅蛋白水平等方面差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。本次研究征得醫院醫學倫理學會同意，所有患者均簽署知情同意書。排除標準：有既往眼部手術患者(除NC組除外)；患有慢性疾病患者；患有腫瘤及免疫系統疾病者；近期患有眼部感染患者。

表1 4組患者基本信息比較

1.2 樣品采集與存儲

用臨床上常用的含抗凝劑的采血管空腹采集所有受試者血液樣本5 ml，將血液放置在室溫下凝結30 min后，3 000 rpm離心10 min取血清，立即將其冷凍在-80℃冰箱中備用；玻璃體樣品采集方法參考之前報道[12]，于玻璃體切除術時收集所有受試者玻璃體液和增生膜組織。于灌注前用玻璃體切割頭收集玻璃體液0.4 ml,于4-6℃保存備用。術中收集 PDR患眼視網膜前增生膜和對照組內界膜組織,于-80℃保存備用。檢測LncRNA H19的玻璃體樣品盛放裝置需提前用RNA酶處理，以便保證RNA的提取質量。

1.3 ELISA試劑盒檢測玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α的檢測

利用ELISA試劑盒檢測玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α水平(ELISA試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司)，檢測方法按產品說明書進行。

1.4 RT-qPCR檢測患者玻璃體和血清中LncRNA H19的表達水平

空腹采集所有受試者血液樣本10 ml，使血液在室溫下凝結30 min后，3 000 rpm離心10 min取血清，立即將其冷凍在80℃冰箱待檢。用總RNA提取試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)提取血清中的總RNA，檢測吸光度值(OD)，若OD260/OD280在1.8-2.0之間則提取符合要求。將總RNA利用反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)反轉錄合成cDNA，以cDNA為模板進行擴增，用2-ΔΔCT表示受試者玻璃體和血清中LncRNA H19的相對表達水平。

1.5 免疫組化檢測LncRNA H19和VEGF-b陽性表達

將PDR組和NC組患者膜組織標本進行常規脫蠟及水化，把組織浸入二甲苯溶液中處理三次，完成后，再分別浸入不同濃度的酒精中。在由100 ml 0.01 mol枸櫞酸緩沖液+3 ml H2O+10 μl曲拉通X-100沖洗、浸泡，PBS沖洗3次，每次3 min；完成后，放入95°水浴加熱修復15 min，冷卻至室溫。沖洗，室溫封閉，滴加一抗，37℃ 30-40 min，沖洗，滴加二抗，37℃ 40 min，沖洗，DAB顯色，水洗終止反應，蘇木素復染，分化，梯度酒精脫水干燥，中性樹膠封固，陽性染色為棕黃色，采用Motic高清晰彩色圖像測量系統分析。

1.6 Western blotting檢測VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表達

用蛋白提取試劑盒提取視網膜組織全蛋白后，經電泳和轉膜后，用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃孵育過夜后PBS緩沖液15 min/3次洗膜后再用二抗室溫下孵育2 h，加入顯色劑曝光后，通過Image-Pro Plus系統分析蛋白條帶灰度值，β-actin作為內參蛋白。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 LncRNA H19和VEGF-b陽性表達

NC組患者視網膜組織中LncRNA H19陽性表達數高于PDR組(P<0.05)，VEGF-b陽性表達數低于PDR組(P<0.05)，見圖1。

圖1 NC組和PDR組患者LncRNA H19陽性表達結果比較

2.2 4組受試者玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α表達水平比較

采用ELISA方法檢測4組受試者玻璃體和血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α表達水平，結果表明與NC組相比，DM組、NPDR組和PDR組三組受試者中隨著視網膜病變的發生以及病程的延長，玻璃體和血清中VEGF-b和IL-6水平逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.05)，VEGF-b在玻璃體和血清中的表達具有一致性。此外，VEGF-b檢測結果與免疫組化結果也具有一致性；TNF-α在四組受試者玻璃體和血清中水平相似，差異無統計學意義，如表2所示。

表2 各組受試者血清中VEGF-b、IL-6、TNF-α水平比較

2.3 4組受試者玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平比較

4組受試者玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平如圖2所示，結果表明NC組受試者LncRNA H19相對表達水平最高，DM組水平次之，PDR組LncRNA H19表達水平最低，玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平趨勢相同，結果具有一致性，由此可知隨著視網膜的病變LncRNA H19表達水平也會降低。

圖2 4組受試者玻璃體和血清中LncRNA H19相對表達水平比較

2.4 Western blotting檢測PDR組和NC組患者膜組織中VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表達

PDR組患者膜組織中VEGF-b、IL-6蛋白表達水平顯著高于NC組(P<0.05)，2組TNF-α無顯著差異，這與免疫組化和ELISA檢測結果一致，如圖3所示。

圖3 PDR組和NC組患者膜組織中VEGF-b、IL-6、TNF-α蛋白表達水平

2.5 PDR組患者血清中VEGF-b、LncRNA H19與IL-6、TNF-α相關性分析

Pearson 相關性分析結果提示血清中VEGF-b濃度與血清中IL-6水平呈線性正相關(r=0.899，P<0.01)，見圖(4A)；而血清中LncRNA H19相對表達水平與血清中IL-6濃度呈線性負相關(r=-0.858,P<0.01)，見圖(4B)。而血清中VEGF-b和LncRNA H19水平與血清中TNF-α濃度無明顯相關關系，相關性結果分別為(r=0.316,P=0.417)(r=-0.146，P=0.649)。

2.6 采用Logistic多元回歸分析VEGF-b和LncRNA H19是否為糖尿病視網膜病變的危險因素

已有無糖尿病視網膜病變為因變量，以VEGF-b、LncRNA H19、病程、家族史、肥胖(IBM≥25 kg/m2)、高齡(≥60歲)、高血脂、飲酒、吸煙為自變量，行Logistic多元回歸分析，結果表明VEGF-b、LncRNA H19、病程為糖尿病視網膜病變的危險因素，見表3。

表3 Logistic多元回歸分析糖尿病視網膜病變危險因素

3 討論

糖尿病性視網膜病變是最常見且最嚴重的眼部并發癥[12]。在2.46億的糖尿病患者中，約有1/3患有糖尿病性視網膜病的跡象，其中1/3可能患有視力威脅性視網膜病，即嚴重的視網膜病或黃斑水腫。另外糖尿病視網膜病變的存在還意味著增加患者全身性血管并發癥的風險[13]。因此早期預防和治療糖尿病性視網膜病變意義重大。本研究發現NC組患者視網膜組織中LncRNA H19陽性表達數高于PDR組，而VEGF-b陽性表達數低于PDR組，LncRNA H19或VEGF-b在玻璃體和血清中的表達結果也具有一致性，提示LncRNA H19和VEGF-b可能在糖尿病性視網膜病變中發揮了重要作用，但仍需要進一步明確。

圖4 PDR組患者血清中VEGF-b與IL-6相關性分析結果(A),PDR組患者血清中LncRNA H19相對表達量與IL-6水平相關性分析結果(B)

IL-6是一種細胞炎性因子，在整個炎癥過程中均起作用，并可能導致血管通透性增加,在胰島素抵抗過程中也發揮著重要作用[14]，很多研究證實其在視網膜病變患者體內水平的增加可能參與了病變的發生發展[15]。本研究結果表明，在DM組、NPDR組和PDR組患者玻璃體和血清中中IL-6水平升高，結果具有一致性，且在PDR患者視網膜組織中IL-6蛋白表達升高，差異有統計學意義，證實IL-6可能參與了糖尿病視網膜病變的發生發展。

本研究通過相關性分析表明PDR患者血清中VEGF-b表達水平與血清中IL-6水平具有正相關關系，而糖尿病無視網膜病變患者玻璃體和血清中VEGF-b表達水平比對照組表達水平升高，且單純型糖尿病視網膜病變組和增殖型糖尿病視網膜病變組患者玻璃體和血清中VEGF-b表達水平更高，提示VEGF-b可能與IL-6一樣參與了糖尿病視網膜病變過程。VEGF-b是VEGF同源物，其在體內可以靶向抑制脈絡膜和視網膜新血管形成。從機理上講，VEGF-b的血管存活作用是通過調節許多經由NP-1和VEGFR-1的血管存活基因的表達來實現的[16]。有研究表明，VEGF-b在血管系統中的功能起著“生存”的作用，而不是“血管生成”因子，因此VEGF-b的抑制作用可能為治療新血管疾病提供新的治療機會[17]。另外本研究檢測膜組織中VEGF-b蛋白表達發現，PDR組患者膜組織中VEGF-b蛋白表達水平顯著高于NC組，這與免疫組化和ELISA檢測結果一致，本研究還發現,VEGF-b是糖尿病視網膜病變的危險因素，推測 VEGF-b可能參與了糖尿病視網膜病變的發生發展，通過抑制視網膜病變患者血清中的VEGF-b水平可能會降低患者病變程度。

在糖尿病中，高糖水平的暴露會降低新生心肌細胞以及鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病大鼠心肌中LncRNA H19的表達，該模型被用作糖尿病模型，研究結果表明LncRNA H19在糖尿病大鼠心肌中表達水平顯著下調，這可能與心肌細胞自噬增加和心臟功能受損有關[18]。本研究結果表明NC組LncRNA H19相對表達水平最高，糖尿病無視網膜病變組水平次之，增殖型糖尿病視網膜病變組LncRNA H19表達水平最低，由此可知隨著視網膜病變的發展LncRNA H19表達水平也會降低，說明LncRNA H19可能與糖尿病視網膜病變有關。此外，相關性分析表明，PDR患者血清中LncRNA H19相對表達水平與IL-6濃度具有負相關關系，Logistic多元回歸分析顯示LncRNA H19是糖尿病視網膜病變的危險因素，因此其水平的降低可能參與了糖尿病視網膜病變的發生和發展。

綜上所述，糖尿病視網膜病變患者玻璃體和血清中VEGF-b水平升高、LncRNA H19水平降低，兩者均為糖尿病視網膜病變的危險因素，可能與病變的發生發展相關，有望為糖尿病視網膜病變的發病機制提供新方向。