生物基1，3-丙二醇連續發酵過程的穩態分析與反饋控制

潘多濤，王旭東，史洪巖，修志龍

（1 沈陽化工大學信息工程學院，遼寧省化工過程控制技術重點實驗室，遼寧沈陽 110142； 2 大連理工大學生物工程學院，遼寧 大連 116024； 3 浙江工業大學藥學院，浙江杭州 310014）

引 言

1,3-丙二醇（PDO）是一種重要的化學品，廣泛應用于化妝品及表面活性劑等，尤其是可用于合成可生物降解材料，如：聚對苯二甲酸丙二酯（PTT）、聚三亞甲基醚乙二醇和雜環化合物等[1]。目前，PDO可以通過化學合成或微生物發酵生產?；瘜W合成過程中存在的高溫高壓、高毒性試劑以及昂貴的催化劑等問題嚴重制約了PDO 的工業化生產。相比之下，以微生物發酵是一種更加溫和、低耗能、低成本以及更加環保的生產方式[2-3]。在可產PDO 的微生物中，肺炎克雷伯氏桿菌（Klebsiella pneumoniae）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）因具有較強的底物耐受性、較高轉化率等優勢而備受關注[4-5]。然而，發酵過程中產物（包括副產物）的毒性和反饋抑制等均會影響微生物的生長和PDO 的產出，這導致最終PDO 含量相對較低，不利于產品質量的提高和生產規模的擴大[6-7]。由于底物、產物和其他因素之間的關系較為錯綜復雜，依靠常規實驗方法很難去深入探究背后的機理。相比之下，采用動力學建模對發酵系統進行機理分析是一種更高效的研究手段，可對目標過程進行有效預測及優化，為實際生產過程提供理論指導[8-10]。

自從Zeng 等[11]提出動力學模型來描述C.butyricum和K.pneumoniae的生長過程后，多種動力學模型被用來描述對應菌株的底物和能量消耗、產物形成以及其他因素的影響關系[12-13]。進一步地，利用數學模型優化K. pneumoniae發酵甘油生產PDO方面已經有不少的研究工作[14-19]，如：Wang 等[20]基于調整結構的模型，分析了甘油發酵過程的振蕩特性，利用Hopf 奇點約束優化了操作條件；Zhu 等[16]、Kaur 等[21]分別利用動力學模型研究C. butyricum和Clostridium diolis的最佳培養條件，并優化營養底物補料策略以獲得較高產量。除此之外，Ye 等[22]、Yang 等[23]利用混雜系統描述批式流加過程，研究了優化控制算法。然而，這些工作主要集中在對模型的分析和潛力的挖掘上，對發酵過程的自動化控制理論方面的研究仍然比較缺乏。而在流程工業智能自動化的背景下，PDO 生物發酵過程的自動化控制顯得尤為重要[9,24-25]。

基于此，本文以K.pneumoniae連續發酵甘油生產1,3-丙二醇過程為研究對象，首先對發酵體系的多穩態特性進行考察，分析連續發酵的穩定性；在此基礎上，設計了一種新型的發酵稀釋率反饋控制系統，以期為PDO 自動化生產奠定一定的理論基礎。

1 方 法

1.1 模型的來源

K. pneumoniae連續發酵模型源于前期研究[17]。該模型主要描述了甘油發酵轉化為PDO 的動力學過程，包括主要代謝物的合成與分解之間的關系，對應的數學描述如下：

其中，X為生物量，g·L-1；D為稀釋速率，h-1；CS0、CS分別為發酵過程中甘油的初始濃度和實時濃度，mmol·L-1；qS為 甘 油 的 比 消 耗 速 率，mmol·g-1·h-1；CPi為細胞外主要產物PDO、乙醇和乙酸的濃度，mmol·L-1；qi為上述三種胞外產物的比生成速率，mmol·g-1·h-1。模型中的參數列于表1[15]。

1.2 穩態分析

微生物發酵過程中影響穩態的因素可通過模型中特定參數的變化反映出來[26]。參數變化導致的系統狀態發生躍遷的現象稱為分支[27]，穩態解的分支與平衡的穩定性密切相關[28]。通過分支分析，能夠分析非線性系統中參數對狀態穩定性的影響。本文采用函數連續性分析工具[29]進行模型多穩態分析。

1.3 控制策略

在已報道的模型分析研究中，連續發酵過程的稀釋速率通常取固定值[15,20]。稀釋速率較高時，底物甘油流加速率較高，反應器中殘余甘油量相對較多，這會導致大量殘余甘油以等速率流出發酵罐，不但造成極大的浪費，還會影響后續產物的分離過程；而稀釋速率較低時，甘油在發酵罐中的駐留時間增大，這能夠使甘油得到比較充分的轉化，但總體的生產強度較低?？梢?，稀釋速率對生產性能和底物利用率有較大影響。因此，在現有模型[式(1)]的基礎上，增加對稀釋速率D的反饋控制，如式(2)所示。

式中，D0為基準參考稀釋速率，h-1；β為稀釋速率的調節增益系數；CeS為期望的殘余甘油濃度，mmol·L-1；CePDO為期望的產物PDO 濃度，mmol·L-1；為期望的產物乙醇濃度，mmol·L-1；w1和w2為稀釋速率調節項的權重占比；T是單位時間，取固定值1 h。

式(2)中的調節項會根據發酵系統中殘余甘油或產物濃度的高低來反饋動態調整稀釋速率D：殘余甘油CS的增加會負向調節D（減少甘油的流加量），而產物濃度CPDO和CEtOH的增加則會正向調節D。

2 結果與討論

2.1 發酵過程的穩態分析

在先前的研究中，發現K.pneumoniae的連續發酵過程具有強非線性特性，存在多穩態現象[17,30]，而且，在相同的操作條件下存在兩種不同的穩定狀態，這種現象不僅與操作條件有關，而且與操作模式有關。例如，在較高稀釋率和較高底物濃度的條件下，底物濃度從低變高或由高到低減小將導致多穩態現象的出現。這種多穩態現象不但在實驗中能夠觀察到[31-32]，而且還可通過對模型式(1)的連續性分析得到印證。因此，在前期工作基礎上，進一步通過雙因素分支分析探究多穩態發生的臨界區域，結果見圖1。

圖1(a)～(e)中的點線、虛線和點劃線分別表示稀釋速率D取0.035、0.1 和0.26 h-1時反應物在不同初始甘油濃度下的穩態值變化趨勢。同時，圖中給出了D取0.1 h-1時不同初始甘油濃度下的反應物濃度實驗值[圖1(a)～(e)中三角形標記]。圖中圓形標記表示出現多穩態時的極限分支點（limit point），任取其中一個極限點進行稀釋速率和初始甘油濃度雙因素的分支分析，會得到一個閉合曲線[圖1(a)～(e)中實線]，該閉環會穿過不同稀釋率下獲得的各個極限點，參數的正向和負向變化結果交匯于尖點分支[cusp point，圖1(a)～(e)中方形標記]，尖點是狀態變化曲線中的一種奇異點，曲線上的點在移動到尖點時將會朝相反的方向移動。

圖1(a)～(e)的結果顯示，在特定的稀釋速率下（如D= 0.1 h-1），穩態曲線都會經過兩個極限分支點，兩個極限點之間的區域不穩定，而兩個極限點之外的區域穩定，表現為典型的雙穩現象（bistable）[33]。此外，當稀釋速率逐步增大時，穩態的不穩定區域會漸漸收縮，伴隨著的是兩個極限點會逐漸重合為一個并與尖點重合，最終多穩態現象會消失（如D=0.26 h-1）；反之，稀釋速率的減小同樣會使不穩定性區域收窄（如D=0.035 h-1）。總體上講，在初期隨著連續補料中甘油濃度的提高，生物量和（副）產物濃度均明顯上升，直至底物甘油過量[如圖1(c)中的拐點附近]。當甘油濃度持續增加時，殘余甘油會迅速上升，此時生物量和乙酸濃度快速降低，相較而言PDO 和乙醇的濃度則相對緩慢地減小，直至接近0（過量的底物完全抑制了反應）。

圖1 發酵過程中不同稀釋速率下的多穩態現象及其臨界區域Fig.1 Multistability phenomenon and its critical region at different dilution rates during fermentation

生物代謝過程中的多穩態現象在大腸桿菌和酵母中均有一些報道[34-36]，其中底物抑制是其中的重要因素[37-38]。因此，推測K. pneumoniae的多穩態現象也與底物抑制[式(1)中的比生長速率]有關，可能原因是甘油作為單一底物在低濃度時扮演酶激活劑的角色，而在高濃度時則可能抑制酶促反應。當體系中的底物濃度從低到高時，細胞內的酶就會被激活從而激勵產物的生成，而隨著底物的進一步提高，則會超過酶的耐受閾值轉而成為抑制劑，此時酶促反應會被抑制，殘余底物濃度會提高而產物則會相應降低；另一方面，若底物濃度從高到低，胞內酶會被抑制較長一段時間，酶的活性較低，因此底物的消耗和產物的形成較少[17,30,32]。由于多穩態現象會對生產產生不利影響，在實際發酵過程中，工作點的選取應盡量避開多穩態的臨界區域[20]。

2.2 發酵過程的優化控制

發酵生產水平不僅取決于生產菌種自身的性能，而且還受限于發酵條件和工藝等因素。本文采用的數學模型已經過大量研究驗證了其可靠性，并在先前的工作中利用集成建模（ensemble modeling）方法進行了發酵過程的操作條件優化，獲得了最優的初始甘油濃度和稀釋速率[15]。然而，在以往的實驗或模擬計算中，通常選取一個恒定的稀釋速率進行研究分析，具有一定的局限性。本文在前述多穩態分析的基礎上，考慮了底物甘油和產物PDO 的反饋控制策略，使得實際的稀釋速率可隨底物和產物的濃度動態調整。根據圖1(f)中稀釋速率和初始甘油濃度的臨界區域（避開多穩態區域），并結合前期工作[15]中集成建模優化結果，設定初始甘油濃度CS0=780 mmol·L-1；在建立的稀釋速率反饋控制方程[式(2)]中，基準稀釋速率D0取0.23 h-1；期望的PDO穩態濃度為CePDO=421 mmol·L-1，期望的殘余甘油濃度 為CeS= 25 mmol·L-1，期 望 的 乙 醇 穩 態 濃 度 為= 50 mmol·L-1；甘油調節項的權重w1取0.1，PDO調節項的權重w2取0.8，而稀釋速率的調節增益系數β取0.15。經控制的優化計算結果如圖2、表2所示。

圖2 不同稀釋速率策略下的模擬結果對比Fig.2 Comparison of simulation results under different strategies for dilution rate

從表2 中的穩態數據可以看出，產物PDO 的濃度提高了約20%，這大大提高了甘油的轉化率（由原來的0.478 mmol·mmol-1提高至0.563 mmol·mmol-1）；相對而言，殘余甘油的濃度反而提高，仔細分析穩態數據可以發現，在未控制稀釋速率的情況下，雖然甘油的殘余量較低，但對產物PDO 生成的貢獻是有限的，有相當比例的甘油轉化為乙醇和乙酸。在施加控制手段后，代謝過程向有利于主產物形成的方向推進，穩態情況下乙醇的濃度下降超過30%，乙酸的濃度也有小幅下降。綜合來看，在以恒定稀釋速率培養時，發酵過程的生產強度為85.70 mmol·L-1·h-1，應用稀釋速率控制策略后，生產強度達到101.10 mmol·L-1·h-1，極大地提高了發酵性能。

表2 不同稀釋速率策略下的穩態值對比Table 2 Comparison of steady values of metabolites under different strategies for dilution rate

另一方面，稀釋速率反饋控制策略極大地縮短了發酵體系達到穩態的時間，這在控制理論中被稱為“調整時間”（settling time），是系統動態性能的綜合指標。調整時間的縮短，意味著發酵系統能夠更快速地進入穩態，提高整體的培養性能。在固定稀釋速率的情況下，甘油以恒定速率（即D）被輸入到反應器中，但發酵初期，生物量有限，轉化的甘油也極為有限，此時大量的殘余甘油被排出反應器，造成極大的浪費。如圖3所示，在采用反饋控制策略后，稀釋速率是動態變化的。在發酵初期，稀釋速率從較小值開始提高，甘油隨著稀釋速率的調整，逐步提高流加量，這與反應器中微生物的增殖趨勢是一致的。在這個階段，甘油流加量的變化是與微生物的轉化能力匹配的，也就是“按需分配”甘油。同時由于稀釋速率不高，流出的發酵液的體積有限。從圖2還可以看出，反饋控制使得調整時間由原來的81.27 h縮短到了34.11 h（幅度超過50%），避免了30多小時的甘油損耗，有利于提高發酵性能。此外，采用恒定稀釋速率的發酵過程，其超調量較大，施加控制手段后，超調量明顯減小，同樣有利于提高發酵性能。

圖3 受控稀釋速率的變化過程Fig.3 Variation of the controlled dilution rate during the fermentation

3 結 論

提出了一種K. pneumoniae連續發酵甘油生產PDO 的自動化控制策略。首先通過數學函數連續性分析工具預測了該過程的多穩態特性，結果表明在不同的初始甘油濃度或稀釋速率下，系統均會出現多穩態現象，通過雙因素分析，獲得了多穩態出現的臨界區域，該區域內部的穩態是不穩定的，在實踐操作中可以依此選擇合適的工作點。在此基礎上，基于反饋控制理論，設計優化了受殘余甘油和產物PDO 及乙醇濃度影響的稀釋速率反饋控制策略，該策略可作為實踐中連續培養的進料方案，經自動控制的稀釋速率在提高產物濃度的同時，極大地縮短了系統達到穩定的調整時間，可大幅度降低發酵初期階段甘油的浪費，提高了發酵過程的甘油的轉化率和生產強度。