火炬松體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的優(yōu)化

胡 珊，楊春霞，谷振軍，杜 強(qiáng)，肖平江，李火根

(1. 江西省林業(yè)科學(xué)院，江西 南昌 330013；2. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3. 安福縣武功山林場(chǎng)，江西 吉安 343200)

火炬松（Pinus taedaL.）作為我國(guó)成功引種的國(guó)外松樹種之一，因其生長(zhǎng)快、用途廣、適應(yīng)性強(qiáng)等特性，成為我國(guó)南方地區(qū)的重要用材樹種和生態(tài)樹種。然而，火炬松育種和生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，常規(guī)有性繁殖子代表型變異大，且種子園建設(shè)成本和維護(hù)成本高、更新慢，在短期內(nèi)不能滿足生產(chǎn)上對(duì)火炬松苗木的需求，限制了火炬松規(guī)模化推廣應(yīng)用。無(wú)性快繁不僅可在短期內(nèi)保質(zhì)保量地規(guī)模生產(chǎn)無(wú)性系苗木，而且還可縮短育種周期，加速育種進(jìn)程。

植 物 體 細(xì) 胞 胚 胎 發(fā) 生 （ Somatic embryogenesis）具有繁殖系數(shù)高、遺傳穩(wěn)定性好、生產(chǎn)周期短、便于規(guī)模化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，是植物良種規(guī)模化繁殖的有效手段之一，在提高森林生產(chǎn)力、可持續(xù)性和林產(chǎn)品一致性方面發(fā)揮重要作用[1]。早在1987 年，美國(guó)學(xué)者[2]開始火炬松體胚發(fā)生技術(shù)研究，初步建立了懸浮培養(yǎng)體系并獲得再生植株。隨著Becwar 等[3]、Li 等[4]、Pullman[5]等學(xué)者對(duì)體胚發(fā)生技術(shù)研究的深入，體胚技術(shù)逐漸成熟，火炬松一些優(yōu)良基因型的體胚誘導(dǎo)率和植株再生率顯著提升，并成功用于商業(yè)化生產(chǎn)[6]。國(guó)內(nèi)對(duì)火炬松體胚發(fā)生方面的研究相對(duì)較少，主要集中在20 世紀(jì)90 年代[7]，雖然近年來(lái)也開展過(guò)一些研究，但效果不理想[8-9]。無(wú)論是國(guó)外還是國(guó)內(nèi)，火炬松體胚發(fā)生技術(shù)研究中仍存在一些共性的、難以克服的技術(shù)問(wèn)題，如某些優(yōu)良基因型的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率低、增殖穩(wěn)定性差、體胚成熟分化同步性低及體胚萌發(fā)率低等[6]，造成大多數(shù)火炬松優(yōu)良基因型目前尚不能通過(guò)體胚發(fā)生途徑進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)。

為此，本研究以江西省推廣應(yīng)用的火炬松良種［贛R-CS0(1)-PT-001-2020(5)］的未成熟種子為材料，對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖、體胚成熟與萌發(fā)、體胚苗移栽等相關(guān)技術(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，以期提高火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)率、體胚成熟分化及植株再生效率，為江西省火炬松良種體胚繁育奠定了基礎(chǔ)，并為其規(guī)模化生產(chǎn)體胚苗提供技術(shù)支撐。

1 試驗(yàn)材料

未成熟球果采自江西省安福縣武功山林場(chǎng)的第1 代火炬松無(wú)性系種子園中6 個(gè)長(zhǎng)勢(shì)好、結(jié)實(shí)量高、且子代速生特性明顯的無(wú)性系（武林1、武林2、武林3、武林16、榮山52、湖南39）。自2019年7 月7 日開始采集，8 月19 日結(jié)束，每周采集1 次，共采集7 次，每株每次采集20～30 個(gè)未成熟球果，隨機(jī)取3 個(gè)球果鏡檢，剩余的放置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1 外植體消毒與接種

未成熟種子先用無(wú)菌水清洗1 遍，然后用75%(v/v)酒精消毒30 s，無(wú)菌水清洗3 遍，再用0.1%(w/v)升汞消毒7～8 min，無(wú)菌水清洗5 遍，最后用無(wú)菌濾紙將種子表面多余的水分吸干，備用。

消毒后的種子用無(wú)菌手術(shù)刀和鑷子剝除種子的外種皮和內(nèi)種皮，將其接種至提前配好的胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每皿10 粒。

2.2 胚性愈傷組織誘導(dǎo)與增殖

設(shè)置不同基因型、基本培養(yǎng)基類型、不同采樣時(shí)間、PGR 不同組合（NAA、6-BA 和KT）及濃度梯度等因素對(duì)火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)影響的試驗(yàn)。

不同采樣時(shí)期、不同基因型的誘導(dǎo)培養(yǎng)基采用DCR 培養(yǎng)基 + 1.0 mg·L?12,4-D + 0.5 mg·L?16-BA + 1.0 mg·L?1NAA + 5.0 mg·L?1ABA；不同基本培養(yǎng)基類型采用基本培養(yǎng)基 + 1.0 mg·L?12,4-D +0.5 mg·L?16-BA + 1.0 mg·L?1NAA + 5.0 mg·L?1ABA；PGR 組合則采用4 因素3 水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在DCR 基本培養(yǎng)基上添加不同PGR 及其濃度的組合。以上培養(yǎng)基同時(shí)添加L-谷氨酰胺450 mg·L?1、肌醇500 mg·L?1、水解酪蛋白500 mg·L?1、2-嗎啉乙磺酸250 mg·L?1、蔗糖30 g·L?1、卡拉膠7.5 g·L?1。每個(gè)處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，(22±1)℃暗培養(yǎng)， 8 周后統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率。

選擇生長(zhǎng)狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，在增殖培養(yǎng)基中（MLP+2.0 mg·L?1NAA+0.5 mg·L?16-BA+0.5 mg·L?1KT+450 mg·L?1L-谷氨酰胺+500 mg·L?1肌醇+500 mg·L?1水解酪蛋白+30 g·L?1麥芽糖+7.5 g·L?1卡拉膠）進(jìn)行繼代，培養(yǎng)條件同誘導(dǎo)培養(yǎng)。

2.3 成熟分化培養(yǎng)

選擇增殖能力強(qiáng)、具有典型的胚性胚柄細(xì)胞團(tuán)結(jié)構(gòu)細(xì)胞系#R52（榮山52 無(wú)性系的未成熟種子誘導(dǎo)的一個(gè)細(xì)胞系），在增殖培養(yǎng)基上增殖10 d 后，稱取鮮質(zhì)量1 g，轉(zhuǎn)接至MLP 基本培養(yǎng)基，暗培養(yǎng)14 d 后再轉(zhuǎn)移至成熟分化培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，成熟培養(yǎng)基設(shè)置ABA 濃度（6、8、10 mg·L?1）、PEG 8 000 濃度（120、140、160 g·L?1）、麥芽糖濃度（20、30、40 g·L?1）3 因素3 水平的正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，同時(shí)添加450 mg·L?1L-谷氨酰胺 、500 mg·L?1肌 醇、 500 mg·L?1水 解 酪 蛋 白、 250 mg·L?12-嗎啉乙磺酸、30 g·L?1麥芽糖、7.5 g·L?1卡拉膠，8 周后統(tǒng)計(jì)成熟胚的數(shù)量。

2.4 萌發(fā)與移栽

將細(xì)胞系#R52 成熟的體細(xì)胞胚胎接種于萌發(fā)培養(yǎng)基G0 和G1（G0=WPM + 肌醇500 mg·L?1+L-谷氨酰胺450 mg·L?1+ 水解酪蛋白 500 mg·L?1+2-嗎啉乙磺酸 250 mg·L?1+ 麥芽糖30.0 g·L?1+ 結(jié)冷膠10 g·L?1，G1=G0 + 3.5 g·L?1活性炭）中進(jìn)行萌發(fā)，先暗培養(yǎng)7 d，然后置光照下培養(yǎng)。組織培養(yǎng)間的環(huán)境控制為：光照強(qiáng)度為50 μmol·m?2·s?2、光照16 h/黑暗8 h，溫度（22±1）℃，濕度為60%～65%。將體胚生根且長(zhǎng)出真葉判定為萌發(fā)，統(tǒng)計(jì)8 周內(nèi)的萌發(fā)率。

體胚萌發(fā)后，將其放在瓶裝的萌發(fā)培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)4～6 周，室溫下開口煉苗1 周后移栽，移栽基質(zhì)按照泥炭土∶珍珠巖=3∶1 的比例配置，光照16 h 的光周期/黑暗8 h、光照強(qiáng)度為50 μmol·m?2·s?2，溫度25 ℃，濕度前兩周控制為85%，后續(xù)兩周濕度控制75%。8 周后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)的計(jì)算，采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較。采用單因素的一般線性模型進(jìn)行方差分析，模型為：

Y=u+F+e

式中：u為平均值，F(xiàn)為處理，e為誤差。

對(duì)各處理的試驗(yàn)結(jié)果平均值進(jìn)行Duncan 多重比較。

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的未成熟合子胚數(shù)/接種的未成熟合子胚數(shù) × 100%。

萌發(fā)率=已萌發(fā)的體胚數(shù)量/萌發(fā)試驗(yàn)體胚起始數(shù)量 × 100%。

移栽成活率=成活的體胚苗數(shù)量/移栽的體胚苗總數(shù)量 × 100%。

3 結(jié)果與分析

3.1 火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)

3.1.1 采集時(shí)期 將火炬松3 個(gè)無(wú)性系不同時(shí)期采集的未成熟種子(圖1a)鏡檢后對(duì)應(yīng)合子胚發(fā)育期，剝除內(nèi)外種皮后（圖1b)接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，胚性愈傷組織(圖1c)誘導(dǎo)率區(qū)別很大，且均以7 月20 日采集的未成熟種子的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高（表1）。由此可推斷，火炬松最佳采樣時(shí)期是7 月20 日，最佳的合子胚發(fā)育期處于裂生多胚期。

注：a. 火炬松球果及其種子；b. 去除種皮的未成熟合子胚；c. 誘導(dǎo)胚性愈傷組織；d. 繼代一次的胚性愈傷組織；e. 體細(xì)胞胚胎的成熟分化培養(yǎng)；f. 成熟的體細(xì)胞胚胎；g. 萌發(fā)試驗(yàn)；h. 壯苗培養(yǎng)；i. 煉苗移栽。Notes: a. Cones and seeds of loblolly pine; b. Immature zygotic embryo with seed coat removed; c. Mature differentiation of embryogenic callus; d. Embryogenic callus subcultured once; e.Maturation culture of T somatic embryos; f. Mature somatic embryos;g. Germination test; h. Strong seedling culture; i. Seedling refining and transplanting.

表1 不同基因型未成熟合子胚在不同采樣時(shí)期的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率Table 1 Effect of different genotypes of immature zygotic embryos on embryogenic callus induction rate at different sampling stages

3.1.2 基因型 將7 月20 日采集的6 個(gè)不同基因型火炬松未成熟種子接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率差別明顯（表2），其中，榮山52 號(hào)未成熟合子胚的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)63.33%；湖南39 號(hào)次之，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)60.00%；武林1 號(hào)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最低，僅為10%。

表2 不同基因型對(duì)胚性愈傷組織的影響Table 2 Effects of different genotype on embryonic callus introduction

3.1.3 基本培養(yǎng)基類型 以武林2 號(hào)未成熟合子胚（7 月20 日）為材料開展不同基本培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)試驗(yàn)（表3），發(fā)現(xiàn)DCR 培養(yǎng)基上胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最高，達(dá)到40.00%，且與其他培養(yǎng)基間差異顯著；其次WPM 和MLP 培養(yǎng)基，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率分別為20.00%和13.33%；而MLV、WV5 和B5 培養(yǎng)基中誘導(dǎo)率較低。

表3 不同基本培養(yǎng)基對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3 Effects of different basic media on embryogenic callus induction

3.1.4 不同PGR 組合及其濃度 榮山52 的未成熟合子胚接種于不同濃度的6-BA、2,4-D、NAA和ABA 的正交設(shè)計(jì)處理的9 種培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基配方為DCR + PGR 組合，結(jié)果（表4）發(fā)現(xiàn)：處理3的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)50.00%；其次是處理7，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)18.33%；處理6 的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率最低。從正交設(shè)計(jì)的方差分析可得，6-BA 濃度、NAA 濃度以及ABA 濃度都對(duì)胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率有顯著影響。

表4 不同PGR 組合及濃度對(duì)榮山52 胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響Table 4 Effects of different PGR combinations and concentrations on embryogenic callus induction rate of Rongshan 52

3.2 體胚成熟分化培養(yǎng)

選擇半透明、粘連狀，且具有典型ESM 結(jié)構(gòu)的#R52 胚性愈傷組織（圖1d）進(jìn)行成熟分化試驗(yàn)。#R52 胚性愈傷組織在成熟分化培養(yǎng)基培養(yǎng)1 周后，胚性愈傷組織表面即可觀察到原胚，此后原胚不斷生長(zhǎng)分化，子葉開始形成，2 個(gè)月左右體細(xì)胞胚胎基本發(fā)育成熟（圖1e、f）。體胚成熟分化培養(yǎng)的9 種處理中體胚誘導(dǎo)率差別明顯（表5、圖2），處理5 對(duì)#R52 胚性愈傷組織成熟誘導(dǎo)效果最好，平均可達(dá)411 個(gè)·g?1成熟胚，最高可達(dá)448 個(gè)·g?1成熟胚；其次是處理3，成熟胚數(shù)量平均達(dá)257 個(gè)·g?1，最高可達(dá)327 個(gè)·g?1。

注： a. 處理1 的體胚；b. 處理2 的體胚；c. 處理3 的體胚；d. 處理4 的體胚；e. 處理5 的體胚；f. 處理6 的體胚；g. 處理7 的體胚；h. 處理8 的體胚；i. 處理9 的體胚。Notes: a. the somatic embryos treated with 1; b. the somatic embryos treated with 2; c. the somatic embryos treated with 3; d. the somatic embryos treated with 4; e. the somatic embryos treated with 5; f. the somatic embryos treated with 6; g. the somatic embryos treated with 7; h. the somatic embryos treated with 8; i. the somatic embryos treated with 9.

表5 培養(yǎng)基組合對(duì)#R52 體胚成熟分化培養(yǎng)的影響Table 5 Effect of medium combination on somatic embryo mature differentiation of #R52

對(duì)成熟分化培養(yǎng)的結(jié)果進(jìn)行方差分析，可得ABA 濃度、PEG 8 000 濃度以及麥芽糖濃度均對(duì)成熟分化培養(yǎng)的影響很大，且3 個(gè)因素影響效果的主次為：麥芽糖>PEG 8 000>ABA。

3.3 萌發(fā)與煉苗移栽

將火炬松成熟胚（圖1f）置于萌發(fā)培養(yǎng)基中萌發(fā)，#R52 細(xì)胞系在添加3.5 g·L?1活性炭的G1 培養(yǎng)基中體胚萌發(fā)率可達(dá)93.33%（表6），優(yōu)于不添加活性炭的G0 培養(yǎng)基。體胚萌發(fā)（圖1g）后，在瓶裝基本培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)（圖1h）4～6 周后，選擇生長(zhǎng)旺盛、根系發(fā)達(dá)的的體胚苗移栽至基質(zhì)中，做好控溫控濕管理，移栽成活率可達(dá)86.30%（表6、圖1i）。

表6 #R52 體胚的萌發(fā)與移栽Table 6 Germination and transplanting on somatic embryos of #R52

4 討論

4.1 胚性愈傷組織誘導(dǎo)

基因型是影響體胚誘導(dǎo)的重要因素之一，已有研究表明，在體胚發(fā)生起始時(shí)存在很強(qiáng)的遺傳累積效應(yīng)和母體效應(yīng)，故在取材時(shí)選擇優(yōu)良基因型對(duì)體胚成功誘導(dǎo)至關(guān)重要[10-11]。不同基因型之間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率存在顯著差異，Tang 等[12]和MacKay等[13]對(duì)火炬松不同家系在相同培養(yǎng)條件下進(jìn)行胚性愈傷組織誘導(dǎo)，均得出相似的結(jié)論。Pullman等[5]對(duì)10 個(gè)開放授粉的火炬松無(wú)性系進(jìn)行了體胚發(fā)生研究，胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高的無(wú)性系可達(dá)33%，部分無(wú)性系誘導(dǎo)困難，不能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織。本研究中，火炬松6 個(gè)基因型在誘導(dǎo)胚性愈傷組織效率上也存在明顯差異，其中，榮山52 和湖南39 兩個(gè)無(wú)性系種子的誘導(dǎo)率均超過(guò)50%，榮山52 的無(wú)性系種子的誘導(dǎo)率高達(dá)63.33%，高于以往的報(bào)道[8-13]。在其他針葉樹種的研究中，如馬尾松（Pinus massonianaLamb.）[14]和云南松（Pinus yunnanensisFranch.）[15]，不同基因型之間胚性愈傷組織誘導(dǎo)率也呈顯著差異，說(shuō)明基因型是影響胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的關(guān)鍵因子。

研究發(fā)現(xiàn)，利用未成熟合子胚為材料更有利于胚性愈傷組織誘導(dǎo)[11,16-17]，且大多研究表明，當(dāng)合子胚發(fā)育處于裂生多胚期時(shí)其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著高于其他發(fā)育階段[18-19]。國(guó)內(nèi)外對(duì)火炬松球果采樣期發(fā)現(xiàn)，其最佳采樣期在7 月中下旬，該時(shí)期合子胚發(fā)育階段大多處于裂生多胚期[3,8]，此時(shí)胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高。本研究結(jié)果與以往研究結(jié)果一致。

培養(yǎng)基成分是誘導(dǎo)體胚成功的關(guān)鍵因子之一，包括基本培養(yǎng)基、PGR 及碳源。基本培養(yǎng)基中某些成分（尤其是氮源和一些金屬離子）的增加或減少能有效促進(jìn)胚性愈傷組織誘導(dǎo)與生長(zhǎng)[20]，Pullman等[21]發(fā)現(xiàn)火炬松未成熟種子在改良的1/2 P6 基本培養(yǎng)基上胚性愈傷組織誘導(dǎo)率最高，隨后，研究表明在基本培養(yǎng)基1/2 P6 基礎(chǔ)上添加一定濃度的MES、生物素和葉酸，可以顯著提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)速度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，DCR 培養(yǎng)基是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的最佳基本培養(yǎng)基，DCR 培養(yǎng)基中NH4+的含量介于MLP 與MLV 培養(yǎng)基之間，NO3?的含量低于MLP 與MLV，DCR 培養(yǎng)基中NH4+：NO3?約為0.38，MLP 約為0.17，MLV 約為0.44，這說(shuō)明適當(dāng)降低氮含量以及調(diào)節(jié)NH4+與NO3?的比例是誘導(dǎo)胚性愈傷組織的關(guān)鍵因素。在增殖培養(yǎng)與成熟分化培養(yǎng)中，本研究發(fā)現(xiàn)，火炬松胚性愈傷組織適合在MLP 中培養(yǎng)，這可能同樣和氮素的含量與比例有關(guān)。在Pullman 等[5]、Tang 等[12]的研究中也有相似的發(fā)現(xiàn)。PGR 是培養(yǎng)基中誘導(dǎo)體胚的決定性因素，火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)中，使用最多的PGR 組合是2,4-D + 6-BA，2,4-D + 6-BA +KT，NAA + 6-BA + KT 等[8,22-23]，且有研究表明向培養(yǎng)基中添加 ABA，火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)作用增強(qiáng)[5,24]。Pullman 等[24]的研究中，在添加1.1 mg·L?12,4-D + 0.45 mg·L?16-BA + 0.43 mg·L?1KT的培養(yǎng)基中，火炬松誘導(dǎo)率最高可達(dá)30.1%。添加1 mg·L?1ABA 可以顯著提高誘導(dǎo)率，32 個(gè)火炬松半同胞家系的平均誘導(dǎo)率可達(dá)17.90%[25]。本研究利用4 種PGR（2,4-D、6-BA、NAA 和ABA）組合顯著提升了火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)效率，誘導(dǎo)率最高可達(dá)50%，明顯優(yōu)于以往的研究結(jié)果。4 種PGR 中6-BA、NAA、ABA 對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響是顯著的，說(shuō)明這3 種PGR 在火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，而高濃度2,4-D 會(huì)導(dǎo)致胚性愈傷組織過(guò)甲基化，抑制體胚的成熟，所以在后續(xù)的培養(yǎng)中應(yīng)及時(shí)調(diào)整，降低2,4-D 的濃度或用NAA 替代。因此，作者認(rèn)為胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率的提高更多的是多種PGR 的聯(lián)合效應(yīng)，尤其是6-BA、NAA、ABA，若要進(jìn)一步提高胚性愈傷組織的誘導(dǎo)率，可在這3 種PGR 濃度的基礎(chǔ)上深入開展試驗(yàn)，但3 種PGR 對(duì)胚性愈傷組織誘導(dǎo)的聯(lián)合效應(yīng)的機(jī)制尚不明確，還需要更加深入的研究。

4.2 體胚成熟分化培養(yǎng)

體胚成熟分化培養(yǎng)是體胚發(fā)生技術(shù)研究中的難點(diǎn)之一，也是限制體胚技術(shù)商業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用的重要因素，在體胚誘導(dǎo)過(guò)程中，體細(xì)胞胚畸形或發(fā)育不完全嚴(yán)重影響后期體胚的萌發(fā)率[26]。眾多研究表明，ABA、PEG 8 000 以及麥芽糖在針葉樹種體胚成熟分化培養(yǎng)中發(fā)揮著重要作用[13,18,27-29]。

適當(dāng)濃度的ABA 促進(jìn)體細(xì)胞胚胎的成熟[30]，針葉樹種中ABA 濃度對(duì)體胚成熟分化培養(yǎng)的作用效果差異顯著。馬尾松[17]在成熟培養(yǎng)基中添加2 mg·L?1ABA，對(duì)細(xì)胞系體胚的成熟效果較好。20 mg·L?1是紅皮云杉（Picea koraiensisNakai）細(xì)胞系體胚成熟的ABA 最佳濃度，能獲得較高的成熟體胚數(shù)量[31]，并且畸形率較低。在對(duì)火炬松體胚的研究中，眾多學(xué)者也對(duì)ABA 在其體胚成熟的作用展開了研究。Kapik 等[32]對(duì)火炬松合子胚的發(fā)育過(guò)程的ABA 估算研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)火炬松合子胚ABA 濃度的峰值出現(xiàn)在合子胚胚胎發(fā)育的早期和晚期。唐巍[33]在對(duì)火炬松懸浮細(xì)胞進(jìn)行成熟培養(yǎng)過(guò)程中，添加5 mg·L?1ABA，能夠觀察到裂生多胚以及子葉原基的分化。Pullman 等[6]在火炬松的體胚成熟分化培養(yǎng)的研究中認(rèn)為，ABA 濃度為9.0 mg·L?1時(shí)，獲得的成熟體胚的數(shù)量較多；而本研究中，火炬松體胚成熟分化培養(yǎng)的最適ABA 濃度為8.0 mg·L?1，稍低于Pullman 的研究結(jié)果，說(shuō)明火炬松不同基因型甚至不同細(xì)胞系之間體胚成熟分化培養(yǎng)所需ABA 濃度可能略有差異。

PEG 在培養(yǎng)基中作為滲透劑的作用可能與誘導(dǎo)水分脅迫、脫水耐受性和一些貯藏儲(chǔ)備的積累有關(guān)，在針葉樹種的體細(xì)胞胚胎發(fā)生研究中也常被用于促進(jìn)體胚成熟[34-35]。在日本黑松（Pinus thunbergiiParl.）[34]體胚成熟培養(yǎng)的培養(yǎng)基中添加0～150 g·L?1PEG 8 000，3～4 周后可見子葉胚，培養(yǎng)8 周左右體胚基本成熟。李亦軒等[36]在對(duì)油松（Pinus tabuliformisCarr.）體胚的成熟培養(yǎng)中亦發(fā)現(xiàn)，成熟胚的數(shù)量隨著PEG4000 濃度（25～100 g·L?1）的增加而增加。Pullman 等[6]的研究中，在成熟分化培養(yǎng)基中添加130 g·L?1PEG 8000，火炬松體胚的成熟度較好，可獲得成熟胚150 個(gè)·g?1。本研究在添加140 g·L?1PEG 8000 的成熟分化培養(yǎng)基中，獲得411 個(gè)·g?1成熟胚，成熟分化培養(yǎng)效率得到顯著提升。PEG 對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的作用，不僅體現(xiàn)在PEG 種類及濃度的差異上，更多的是PEG 和培養(yǎng)基的其他添加劑對(duì)體胚發(fā)生產(chǎn)生的組合效應(yīng)，這也表明體胚成熟過(guò)程的生理生化反應(yīng)及其調(diào)控機(jī)制是極其復(fù)雜的。

糖類物質(zhì)是體胚發(fā)生過(guò)程中必不可少的添加劑之一，不僅給體細(xì)胞胚胎生存和發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，還能調(diào)控培養(yǎng)基的滲透勢(shì)[37]。針葉樹種體胚成熟培養(yǎng)中常用的糖類多為麥芽糖和蔗糖，糖的濃度也對(duì)體胚成熟培養(yǎng)有顯著影響。Xia 等[17]發(fā)現(xiàn)，馬尾松使用麥芽糖進(jìn)行體胚成熟培養(yǎng)效果較好，且增加麥芽糖的濃度提高了產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的能力，但在高濃度（30.0～40.0 g·L?1）之間沒有顯著差異。Peng 等[38]則認(rèn)為，蔗糖有利于紅松（Pinus koraiensisSieb. et Zucc.）體胚成熟培養(yǎng)，并且蔗糖濃度對(duì)紅松體胚的成熟有極顯著影響，68.5 g·L?1蔗糖可獲得成熟胚134 個(gè)·g?1。在火炬松中，麥芽糖比蔗糖更能促進(jìn)火炬松體胚的成熟[6-8],吳麗君[39]在添加蔗糖的成熟培養(yǎng)基中未獲得成熟胚，Pullman 等[6]通過(guò)添加60 g·L?1麥芽糖，能獲得150 個(gè)·g?1成熟胚。本研究發(fā)現(xiàn)，用40.0 g·L?1麥芽糖效果最佳，且體胚成熟效率較以往研究有顯著提升。

在對(duì)火炬松體胚的研究中發(fā)現(xiàn)，ABA、PEG 8000 以及麥芽糖的濃度均對(duì)其體胚成熟分化培養(yǎng)具有極顯著影響，其中，麥芽糖濃度的影響最顯著。ABA、PEG 和麥芽糖對(duì)火炬松體胚成熟分化的影響都不是獨(dú)立產(chǎn)生作用，也不是簡(jiǎn)單的累加效應(yīng)，而是三者聯(lián)合時(shí)共同對(duì)火炬松體胚成熟分化產(chǎn)生的促進(jìn)作用。

5 結(jié)論

通過(guò)對(duì)火炬松體細(xì)胞胚胎發(fā)生各培養(yǎng)環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化研究，總結(jié)出一套技術(shù)較為成熟的火炬松體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)體系。火炬松胚性愈傷組織誘導(dǎo)的最佳條件為：以處于裂生多胚期（約7 月20 日左右）的榮山52 無(wú)性系的合子胚為最佳起始材料，其胚性愈傷組織誘導(dǎo)率可達(dá)63.33%；誘導(dǎo)培養(yǎng)最適PGR 組合是0.5 mg·L?16-BA+ 1.0 mg·L?12,4-D+2.0 mg·L?1NAA+ 5.0 mg·L?1ABA；在成熟分化培養(yǎng)基MLP + 8.0 mg·L?1ABA + 140.0 g·L?1PEG 8000 +40.0 g·L?1麥芽糖 + 7.5 g·L?1卡拉膠中，可獲得411個(gè)·g?1成熟胚；在添加活性炭的WPM 培養(yǎng)基上，體胚萌發(fā)率可達(dá)93.33%。

致謝：感謝美國(guó)艾博金林木種苗公司（ArborGen Inc.）和南京林業(yè)大學(xué)陳金慧教授在研究中給予的幫助和指導(dǎo)。