根癌農桿菌介導火龍果潰瘍病菌遺傳轉化體系的構建及轉化子篩選

王偉偉，安馨媛，陳俊菁

（海南大學 林學院/海南省熱帶特色花木資源生物學重點實驗室，海口 570228）

火龍果又名紅龍果，屬仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus），是極具發展前景的熱帶和亞熱帶水果[1]。火龍果因具有較高的經濟價值和營養價值，集蔬菜、水果、花卉和保健于一體，被譽為“21世紀保健食品和果品珍品”， 受到人們的青睞，具有廣闊的國際、國內市場[2]。火龍果20世紀80年代才引入我國臺灣，雖然在我國栽培歷史較短，但發展迅速，目前主要在臺灣、海南、廣西、廣東、福建、貴州等省區種植。潰瘍病是近年來火龍果種植園發生的嚴重真菌病害之一，發病率高達 60%[3?7]。潰瘍病造成火龍果枝條腐爛，果實變黑，失去食用價值，有些果園甚至顆粒無收。該病害在夏秋季高溫高濕的氣候條件下發病尤為嚴重，尤其臺風過后更容易大面積暴發，這也是該病在海南地區盛行的主要原因之一。該病害由新暗色柱節孢（Neoscytalidium dimidiatum(Penz.) Crous &Slippers）侵染引起的[4?11]，開展病原菌的致病機理研究可以為病害防治所需新藥以及抗性種苗的研發提供相關的理論依據，從而達到對病害長期、有效的防控。病原菌基因功能缺失突變體的構建是研究病原菌致病機理的有效手段，這一方法的關鍵技術是建立遺傳轉化體系。農桿菌介導的遺傳轉化（Agrobaeterium tumefaciens-Meidated Transformation）可快速構建真菌 T-DNA（transfer DNA）隨機插入突變體，因其操作簡單，可轉化完整的細胞，比如分生孢子、菌絲、子實體等，免去了制備原生質體的繁瑣，廣泛應用于多種真菌[12]。目前已有100多種真菌使用該方法進行成功轉化[13]，比如玉米大斑病菌[14]、稻瘟病菌[15]、尖鐮孢菌[16]、玉米灰斑病菌[17]等。本研究擬建立根癌農桿菌介導的火龍果潰瘍病菌的遺傳轉化體系，為火龍果潰瘍病菌致病機理的研究奠定技術基礎。

1 材料與方法

1.1 材料火龍果潰瘍病菌野生型菌株由本實驗室分離、鑒定和保存。農桿菌菌株EHA105由海南大學熱帶農林學院陳銀華教授饋贈。載體pXEH8279 (KanaR, HygBR)由吉林大學植物科學學院潘洪玉教授饋贈。實驗用培養基IM、IAM[12]。

1.2 火龍果潰瘍病菌對潮霉素（HygB）最低耐受濃度的確定將火龍果潰瘍病菌野生型菌株接種在PDA培養基上活化，待長至菌落直徑約5 cm時，用5 mm打孔器在菌落邊緣打孔取菌餅，并將菌餅轉接在加有不同濃度 HygB（0、25、50、100、150 μg·mL?1）的 PDA 培養基上，置于 25 ℃ 培養箱中避光培養。每處理3重復，培養7 d后，觀察菌落生長情況，確定最佳的HygB篩選濃度。

1.3 遺傳轉化

1.3.1 農桿菌的準備將攜帶有質粒 pXEH8279的農桿菌菌株EHA105在盧里亞?貝爾塔尼平板培養基 (LB)[ 利福平 (rif) 10 μg·mL?1,卡那霉素(Kana) 50 μg·mL?1]上劃線，置于 28 ℃ 培養至長出單菌落。挑取單菌落轉移至新的LB平板培養基（rif 10 μg·mL?1, Kana 50 μg·mL?1）上劃線，28 ℃培養48 h后，用滅菌的藥匙刮取農桿菌，使其分散在 IM 培養基內，28 ℃，200 r·min?1，培養 4～6 h，使其OD600達到0.5，置于50 mL無菌管中備用。

1.3.2 火龍果潰瘍病菌分生孢子的準備將活化的火龍果潰瘍病菌野生型菌株接種在PDA培養基上，28 ℃培養7 d后，吸取0.01%吐溫20于培養基上，用無菌棉棒將分生孢子輕輕洗下，然后用4層滅菌紗布過濾，制成分生孢子懸浮液。取適量分生孢子懸浮液于PD培養基中，調整分生孢子濃度至 5×105個·mL?1，避光放置在搖床上，轉速為150 r·min?1，室溫下萌發 24 h。

1.3.3 共培養誘導培養的農桿菌與萌發的分生孢子懸浮液等體積混合后，于 25 ℃，80 r·min?1，搖培 20～30 min。吸取 100 μL 混合液，涂布在共培養培養基（IAM, Induced Agar Medium）上，置于 25 ℃黑暗培養。共培養 48 h后，在IAM上倒篩選培養基，置于25 ℃培養。篩選培養基即加有潮霉素（HygB，50 μg·mL?1）、頭孢霉素（Cef, 200 μg·mL?1）、氨芐青霉素（Amp, 200 μg·mL?1）的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基。培養5～6 d后即可見有單菌落長出。

1.4 不同因素對轉化效率的影響根據以上遺傳轉化方法，依次驗證以下因子對火龍果潰瘍病菌遺傳轉化效率的影響，包括農桿菌濃度OD600（0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8）、分生孢子萌發時間（0、6、12、24、36、48 h）以及共培養溫度（20、25、28、30、35 ℃），采用單因素試驗，每個處理設置3個重復。

1.5 轉化子的聚合酶鏈式反應（PCR）鑒定隨機挑選8株轉化子以及野生型菌株接種在PDA培養基上，置于28℃培養箱中培養。4 d后，用無菌槍頭分別刮取培養基中的菌絲，轉移至1.5 mL離心管中。分別向裝有菌絲的離心管加入液氮，并用無菌塑料研磨棒迅速將菌絲研磨成粉狀，利用 CTAB（Hexadecyl trimethyl ammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨）法提取轉化子及野生型菌株基因組DNA。以HygB抗性基因片段為模板設計引物 hygF (5′-gaagaatctcgtgctttcag-3′)和 hygR(5′-gtacttctacacagccatcg-3′)，通過 PCR 方法驗證 TDNA片段是否插入，目標片段長度880 bp。PCR擴增程序：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 變性 40 s，56 ℃退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min，30 個循環；72 ℃ 延伸7 min。

1.6 轉化子篩選

1.6.1 轉化子菌落形態觀察及產孢能力比較將隨機選取的200株轉化子以及野生型菌株接種在PDA 培養基上，28 ℃ 培養 4 d 后，用 5 mm 打孔器分別在菌落邊緣取菌餅，并將菌餅轉移至新的PDA培養基上，置于28 ℃ 培養箱中培養 7 d，觀察菌落形態特征并拍照后，收集分生孢子，計算每皿產生的分生孢子數量。每個處理設置3個重復。

1.6.2 轉化子致病力采用田間接種方法，篩選致病力降低的轉化子。具體操作如下：將轉化子及野生型菌株分別接種在PDA培養基上，置于28 ℃ 培養箱中培養 4 d 后，用 5 mm 打孔器分別取菌落邊緣菌餅；在海南大學儋州校區農科基地火龍果種植園選取健康的火龍果植株，用無菌刀片在莖上劃出5 mm左右傷口，將菌餅轉移至傷口處，并用保鮮膜包裹以保持濕度[（28±2)℃，RH80%]。3 d后觀察發病情況并拍照。

2 結果與分析

2.1 火龍果潰瘍病菌對HygB的最低耐受濃度當 HygB 濃度為 50 μg·mL?1時該菌完全不能生長（圖1），故選取該濃度為火龍果潰瘍病菌對HygB的最低耐受濃度，用于后續實驗中轉化子的篩選。

2.2 火龍果潰瘍病菌遺傳轉化體系的建立當農桿菌濃度OD600為0.5時遺傳轉化效率最高，與其他處理差異顯著（圖2-A）；當分生孢子萌發時間為24 h時遺傳轉化效率最高，與萌發時間為36 h時差異不顯著，而與其他處理差異顯著（圖2-B），但分生孢子萌發36 h實驗周期較長，且菌絲萌發造成實驗操作難度加大，故選取分生孢子萌發24 h作為最優；當共培養溫度為25 ℃時遺傳轉化效率最高，且與其他處理差異顯著（圖2-C）。通過以上研究，農桿菌濃度OD600=0.5、分生孢子萌發時間24 h、共培養溫度25℃時遺傳轉化效率最高，達到833個轉化子/106個分生孢子。

2.3 轉化子的 PCR鑒定提取轉化子基因組 DNA，通過PCR的方法擴增T-DNA片段上HygB抗性基因，結果顯示，8株轉化子均能擴增出HygB抗性基因片段（880 bp），初步可以確定T-DNA成功插入以上轉化子基因組中（圖3）。

2.4 轉化子篩選結果野生型菌株氣生菌絲旺盛，直立，后期顏色為灰黑色；通過與野生型菌落形態比較，發現轉化子0-3-1和3-3-1菌落形態差異較大，氣生菌絲濃密，呈白色，且轉化子3-3-1不產生分生孢子；轉化子24-3-2氣生菌絲稀疏，顏色變淡（圖4-A）。轉化子與野生型菌株產孢能力比較，發現4株產孢量減少的菌株分別為3-1-2、3-1-3、3-2-3和 3-7-1，其中，3-1-3、3-2-3與野生型差異顯著（P＜0.05）， 3-1-2、3-7-1 與野生型差異極顯著（P＜0.01）；發現5株產孢量增加的菌株分別為3-6-2、3-4-1、3-4-2、3-3-1和 0-3-1，其中，0-3-1與野生型差異顯著（P＜0.05），其余4株與野生型差異極顯著（P＜0.01）（圖4-B）。通過接種實驗，發現 6 株致病力下降的菌株分別為0-3、3-3-1、3-6-1、3-7-1、24-2-1、24-3-2（圖4-C）。以上轉化子可用于后續實驗。

3 討 論

據文獻報道，影響根癌農桿菌介導絲狀真菌遺傳轉化效率的因素有很多，比如根癌農桿菌菌株的選擇、農桿菌濃度、真菌分生孢子濃度、共培養時間及共培養溫度等[12]。有研究表明，不同根癌農桿菌菌株對遺傳轉化效率的影響很大，已報道的用于絲狀真菌遺傳轉化的農桿菌菌株有AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA4404 等，本研究選用EHA105菌株，實驗證實可以成功轉化。乙酰丁香酮（As）是該體系能否轉化成功的決定性因素，根據文獻報道，多數絲狀真菌在As濃度為200 μmol·L?1時遺傳轉化效率最高[18]，本研究中 As選用該濃度。轉化受體的細胞濃度對遺傳轉化效率亦有影響，受體孢子濃度較高，轉化效率也較高，本研究中發現分生孢子濃度過高會導致真菌過量生長而無法挑出轉化子，設置分生孢子濃度為5×105可以獲得較高的轉化效率。據文獻報道，共培養時間以48 h轉化效率最高[19]，共培養時間過長反而會導致遺傳轉化效率降低，本研究選取共培養48 h。

本實驗主要研究了農桿菌濃度、分生孢子萌發時間及共培養溫度對遺傳轉化效率的影響。理論上，農桿菌濃度越高，受體細胞被成功轉化的概率越高，遺傳轉化效率越高，然而事實上，當農桿菌濃度過高時遺傳轉化效率反而降低，本研究中，當農桿菌OD600為0.5時火龍果潰瘍病菌的遺傳轉化效率最高，高于0.5則遺傳轉化效率降低。有研究表明，未萌發的分生孢子作為受體不能夠成功轉化[14,20]。本研究發現，當分生孢子萌發 24 h時遺傳轉化效率最高，證實分生孢子受體的形態對火龍果潰瘍病菌的遺傳轉化效率影響很大。研究者對20 ~37 ℃內農桿菌的轉化效率進行研究，發現22～25 ℃是最適的共培養溫度[21]。本研究亦發現，25 ℃是火龍果潰瘍病菌遺傳轉化的最適共培養溫度。

通過農桿菌介導的遺傳轉化構建病原真菌的T-DNA 隨機插入突變體庫，從中篩選致病力降低的突變體，并獲得T-DNA側翼序列，從而獲得致病相關基因，這是目前研究病原真菌致病機制的主要方法之一。本研究通過建立的根癌農桿菌介導的遺傳轉化體系，獲得T-DNA插入轉化子，并從中篩選致病力降低的轉化子，這些轉化子可用于后續研究中，以獲得致病相關的基因，通過致病相關基因功能研究，以闡明火龍果潰瘍病菌的致病機理。