西紅花球莖腐爛病拮抗真菌的篩選、鑒定及抑菌機制

陸潔淼，張家豪，明乾良，王 潔，周桂芬，朱 波*，秦路平*

西紅花球莖腐爛病拮抗真菌的篩選、鑒定及抑菌機制

陸潔淼1，張家豪1，明乾良2，王 潔1，周桂芬1，朱 波1*，秦路平1*

1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 311402 2.陸軍軍醫大學（第三軍醫大學）藥學與檢驗醫學系，重慶 400038

篩選西紅花球莖腐爛病拮抗真菌，探討其抑菌機制。以前期分離得到的24株西紅花內生真菌為材料，采用平板對峙法篩選球莖腐爛病拮抗真菌；應用ITS分子技術進行菌種鑒定，用掃描電鏡觀察拮抗后病原菌尖孢鐮刀菌菌絲形態；檢測拮抗菌株CS05菌絲產生β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質酶的含量及病原菌產堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）的含量。篩選得到對尖孢鐮刀菌有顯著拮抗作用的內生真菌8株，其中CS05抑制效果最好，相對抑制率為（76.53±3.82）%；將CS05鑒定為擔子菌門多孔菌目栓菌屬真菌變色栓菌；CS05能產生β-1,3-葡聚糖酶與幾丁質酶，促使尖孢鐮刀菌胞外AKP含量增加，菌絲出現稀疏紊亂、纏繞皺縮等現象。西紅花內生真菌CS05能較好地拮抗球莖腐爛病菌尖孢鐮刀菌，為西紅花球莖腐爛病的生物防治提供了參考依據。

西紅花；球莖腐爛?。粌壬婢?；拮抗活性；抑菌；β-1,3-葡聚糖酶

西紅花L.是鳶尾科番紅花屬多年生植物，是世界名貴珍稀中藥材，全株僅雌蕊的三分叉紅色絲狀柱頭入藥，產量低而價值高，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效，主治經閉癥痕、產后瘀阻、溫毒發斑、憂郁痞悶、驚悸發狂[1]。西紅花病害主要有球莖腐爛病與病毒病2類，由尖孢鐮刀菌引起的球莖腐爛病是目前已知的最具破壞性的西紅花病害[2]。以浙江省為例，每年有30%～50%的西紅花種植面積遭受病害[3]。目前對于該病害的防治在實際生產中依然多用化學藥液（主要為多菌靈等）噴灌或溴甲烷熏蒸土壤[4]，以減輕病情的發展。然而長期使用化學農藥會對環境及生態系統產生不良影響[5]，并影響與植物相關的有益微生物區系，同時存在病原菌耐藥性的問題[6]。生物防治是植物病害防治的重要措施，植物內生菌能提高宿主抗病性已被多次報道[7-9]。目前對內生真菌防治尖孢鐮刀菌的研究主要集中在農作物上，如防治黃瓜黃萎病、番茄枯萎病和西瓜枯萎病等[10-13]，關于藥用植物內生真菌提高宿主抗病性的研究鮮有報道。

研究表明，真菌主要通過分泌病程相關蛋白（如幾丁質酶、葡聚糖酶等）、與病原菌競爭生態位和營養物質等方式，抑制病原菌生長[14-15]。趙沛等[16]發現棉花內生真菌腐皮鐮刀菌CEF-373可以上調棉花幾丁質酶基因表達，從而破壞病原真菌大麗輪枝菌的細胞壁，抑制病原菌生長。本研究在前期建立的西紅花內生真菌資源庫的基礎上，篩選能拮抗球莖腐爛病病原菌尖孢鐮刀菌的內生真菌，并探討其抑菌機制，為西紅花內生真菌資源開發及球莖腐爛病生物防治提供實驗依據。

1 材料與儀器

1.1 供試菌株

24株西紅花內生真菌及病原菌尖孢鐮刀菌由本實驗室前期分離保存。高山被孢霉（CGMCC，編號3.12824）和哈茨木霉（CGMCC，編號3.15684）購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試劑與儀器

2×Taq Mix（＋Dye），莫納生物科技有限公司；DL 1000 DNA Marker，寶日醫生物技術（北京）有限公司；幾丁質酶活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；β-1,3-葡聚糖酶（β-1,3-GA）活性檢測試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；AKP試劑盒，南京建成生物工程研究所；SU8010型場發射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；UV-3600型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；SW-CJ-2FD型超凈工作臺（上海博訊實業有限公司）；YXQ-LS-75S11型立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博迅實業有限公司）；LMI-100型霉菌培養箱（上海龍躍儀器設備有限公司）；MC-100B型立式恒溫搖床（上海牟測儀器科技有限公司）；GenoSens 1850型凝膠成像分析系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；Applied Biosystems Veriti 96 Well PCR Thermal Cycler型（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Centrifuge 5427R型臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。Thermo Fisher Multiskan FC 1510型全自動酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

2 方法

2.1 內生真菌抑菌活性篩選

用平板對峙法測定供試菌株對病原菌的抑菌活性，共設24個內生真菌處理組，2個陽性對照組（高山被孢霉處理組、哈茨木霉處理組），病原菌空白對照組，計算相對抑制率，實驗平行3次。

相對抑制率＝(對照病原菌菌落直徑－對峙病原菌菌落直徑)/對照病原菌菌落直徑[16]

2.2 內生真菌ITS分子鑒定

無菌條件下挑取少許CS05菌絲置于PDA培養基中活化。28 ℃避光培養7 d，根據徐麗莉[17]研究的方法提取基因組DNA。供試真菌的ITS和5.8S基因采用通用引物ITS4（5’-TCCTCCG- CTTATTGATATGC-3’）及ITS5（5’-GGAAGTAA- AAGTCGTAACAAGG-3’）進行擴增。50 μL PCR反應體系：DNA模板1 μL，稀釋10倍后的引物各1 μL，2×Taq Master Mix（Takara Bio）25 μL，ddH2O 2 μL，擴增程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性40 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，共30次循環；最終72 ℃延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖電泳檢測合格后，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。擴增產物測序結果通過NCBI進行BLAST比對，然后用MEGA 7.0軟件進行序列相似性分析，鄰接樹（neighbor-joining）方法建立系統發育樹。

2.3 掃描電鏡觀察

參考侯媛媛[18]的方法進行掃描電鏡樣品處理，經過固定、脫水、干燥和噴金后在掃描電鏡下觀察對照組病原菌與處理組病原菌的菌絲形態。

2.4 活性酶含量測定

無菌條件下挑取少許CS05菌絲置于PDA培養基中活化。28 ℃避光培養7 d。培養結束后，分別按照β-1,3-GA活性測定試劑盒與幾丁質酶活性測定試劑盒中提供的方法，采用分光光度計測定酶活性，實驗設3次重復。β-1,3-GA以每毫克組織每小時分解幾丁質產生1 μmol-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1個酶活性單位，幾丁質酶以每毫克組織每小時產生1 mg還原糖定義為1個酶活單位。

對CS05進行發酵，28 ℃，180 r/min振蕩培養7 d后，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min），收集上清液，用0.22 μm孔徑的無菌濾器濾過除菌制成無菌發酵液，4 ℃保存待用[19-21]。

采用微量法測病原菌胞外AKP含量，設CS05無菌發酵液處理組，以哈茨木霉為陽性對照，無菌PDB為對照組。對尖孢鐮刀菌進行發酵，發酵液經真空抽濾，取得新鮮菌絲用無菌水反復沖洗后，每稱取菌絲鮮質量2 g分裝在一個離心管內。向離心管中分別加入30 mL真菌無菌發酵液和無菌PDB，混勻后置于28 ℃，180 r/min條件下繼續培養，分別在0、2、4、6、9、12 h定時取混合液5 mL，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min），收集上清液，按照AKP試劑盒中提供的方法，采用酶標儀對AKP含量進行測定，以100 mL液體在37 ℃與基質作用15 min產生1 mg酚為1個金氏單位（1金氏單位＝7.14 U/L），實驗設3次重復[22]。

2.5 數據分析

通過SPSS 25.0軟件對于實驗數據進行方差分析，采用Duncan多重極差檢驗（DMRT）進行統計學分析，＜0.05被認為存在顯著性差異。

3 結果與分析

3.1 內生真菌對尖孢鐮刀菌的拮抗作用

平板對峙結果顯示，從24株供試菌株中篩選出對尖孢鐮刀菌有顯著拮抗作用的內生真菌8株，占比33.33%；其中CS05對病原菌尖孢鐮刀菌的抑菌效果最好，相對抑制率為（76.53±3.82）%，顯著高于陽性對照高山被孢霉（53.06±5.20）%和哈茨木霉（57.75±3.45）%（＜0.05）（圖1）。

3.2 CS05菌種鑒定

CS05的ITS序列經過PCR擴增后，電泳圖見圖2-A。以CS05的ITS和5.8S基因為靶序列，用Blast程序在GenBank中進行DNA序列相似性搜索。結果表明，CS05與變色栓菌有較高序列相似性。下載比對網頁中相似性最高的3個參考菌株序列，用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹，用于系統發育分析，以Agaricales （Basidiomycota）的（MN557371）作為外群。系統發育樹顯示CS05與（MW742535）、（MW742533）、（KY950437）聚在一起，其序列相似性均為99.33%，形成支持強度為100%的末端分支。

CS05菌落在PDA平板上呈白色，圓形，凸起，干燥，可見細長菌絲，中間緊密，邊緣稀薄，隱約可見同心環帶（圖2-B），結合變色栓菌形態特征[23]，將CS05鑒定為擔子菌門栓菌屬變色栓菌。

3.3 CS05對病原菌菌絲形態影響

掃描電鏡顯示，空白對照組尖孢鐮刀菌菌絲粗壯稠密，光滑均勻，整體平整飽滿，且排列有序（圖3-A、B、C）；經CS05拮抗后，尖孢鐮刀菌菌絲較為稀疏，排列紊亂（圖3-D），菌絲出現纏繞（圖3-E箭頭處）、皺縮等現象（圖3-F箭頭處）。說明CS05對尖孢鐮刀菌的菌絲生長有較大的影響。

3.4 活性酶含量測定

結果表明，CS05能產生幾丁質酶和β-1, 3-GA產量分別為（1.880 0±0.004 4）U/mg與（0.600 0±0.002 7）U/mg。CS05無菌發酵液與尖孢鐮刀菌菌絲體共培養4 h后，AKP活性顯著增強，4～6 h略有下降，6～12 h又出現上升趨勢（圖4）。真菌胞外AKP活性增強可作為細胞壁被破壞的重要指標之一[22]，方差分析顯示，共培養12 h后，CS05處理組AKP（10.06±0.88）U/L顯著大于對照組（4.72±1.31）U/L和陽性對照組（5.27±0.71）U/L（＜0.05），表明CS05無菌發酵液對病原菌尖孢鐮刀菌細胞壁的破壞可能是抗菌作用的重要機制之一。

A、B、C-對照組 D、E、F-CS05處理組

*表示0.05水平上有顯著差異，P＜0.05

4 討論

本實驗從24株內生真菌中篩選得到一株能顯著抑制尖孢鐮刀菌菌絲生長的菌株CS05，鑒定為擔子菌門多孔菌目栓菌屬變色栓菌，該菌種序列已上傳至NCBI，Genbank號為：MZ030718，同時專利保藏于中國菌種保藏中心，保藏號為CGMCC No.21948。為栓菌屬真菌，能夠分泌胞外氧化酶如木聚糖酶、錳過氧化物酶、漆酶等從而降解木質素[24]，通常被用作商業化生產漆酶，作為有機污染物降解劑、農藥污染降解劑、工業廢水降解劑等[25-26]。在植物病害的防治方面，Lorito等[27]曾利用從培養濾液中提純的蛋白質組防治谷類作物病原菌，結果表明的胞外蛋白質組對的生長有顯著的抑制作用。本實驗篩選得到的西紅花內生真菌CS05對西紅花病原菌尖孢鐮刀菌具有較強的抗性，為西紅花球莖腐爛病的生物防治提供了菌種資源。

真菌細胞壁降解酶的產生被認為是抑制病原菌生長的重要特性之一[28-29]。植物病原真菌的細胞壁主要組成成分為幾丁質和β-1,3-葡聚糖等[30]，幾丁質酶可以催化幾丁質水解，在裂解真菌細胞壁、抑制真菌生長的過程中起重要作用[31]，β-1,3-GA是一類能特異作用于β-葡聚糖中β-1,3-糖苷鍵的水解酶，因此該酶的水解活性能夠抑制真菌的生長與增殖[32]。本研究發現，CS05能產生幾丁質酶和β-1,3-GA，促進了病原菌胞外AKP含量積累，這可能是加速病原菌細胞壁裂解，導致菌絲排列稀疏，出現皺縮、纏繞與萎蔫情況，最終導致病原菌死亡的原因。今后將對CS05在西紅花體內定殖情況、與西紅花共生及對宿主生長的影響、田間生防效果等進行進一步的研究，為西紅花球莖腐爛病防治提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Screening, identification, and antifungal activity of endophytic fungi fromand their antagonistic mechanism

LU Jie-miao1, ZHANG Jia-hao1, MING Qian-liang2, WANG Jie1, ZHOU Gui-fen1, ZHU Bo1, QIN Lu-ping1

1.School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 311402, China 2.Department of Pharmacognosy, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing 400038, China

To screen antagonistic fungi against corm rot pathogenic fungus of() and explore its antifungal mechanism.Twenty-four endophytic fungi isolated fromwere used to screen antagonistic fungi against corm rot pathogenic fungus via plate confrontation method.Molecular biological methods were used to identify the antagonistic strain.The antifungal mechanism was studied by scanning electron microscope, detecting the β-1,3-glucanase, chitinase and alkaline phosphatase activity.Eight endophytic fungi strains were screened since they possessed a significant antagonistic effect against.Among them, CS05 had the best inhibitory effect whose relative inhibitory rate was (76.53 ± 3.82)%.Moreover, CS05 was identified as.Enzyme activity assay showed that CS05 could produce β-1,3-glucanase and chitinase, and increase extracellular alkaline phosphatase content ofsignificantly, causing sparse and disordered growth, twining and shrinking ofmycelia.The endophytic fungus CS05 could effectively antagonize, which provided a reference for the biological control of corm rot of

L.; corm rot disease; endophytic fungi; antifungal activity; antagonistic mechanism; β-1,3-glucanase

R286.2

A

0253 - 2670(2022)10 - 3165 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.027

2021-11-06

浙江省一流學科（中藥學）開放基金項目（ZYAOX2018011）；浙江省公益技術研究計劃項目（LGN21H280001）；浙江中醫藥大學人才專項（2021ZR09）；浙江省醫藥衛生青年創新人才支持計劃（2022492838）

陸潔淼（1997—），女，浙江杭州人，碩士研究生，研究方向為中藥品質評價。E-mail: 201911114011486@zcmu.edu.cn

通信作者：朱 波，博士，副研究員，碩士生導師，研究方向為植物內生菌。E-mail: zhubo@zcmu.edu.cn

秦路平，博士，教授，博士生導師，研究方向為中藥資源及品質評價。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責任編輯 時圣明]