基于UPLC-Q/TOF-MS的金振口服液在大鼠體內外源物表征

張嘉穎，李海波，劉苓嫻，石丹楓，王振中，曹 亮，姚新生，肖 偉*，于 洋*

基于UPLC-Q/TOF-MS的金振口服液在大鼠體內外源物表征

張嘉穎1，李海波2，劉苓嫻1，石丹楓1，王振中2，曹 亮2，姚新生1，肖 偉2*，于 洋1*

1.暨南大學中藥及天然藥物研究所，廣東 廣州 510632 2.江蘇康緣藥業股份有限公司中藥制藥過程新技術國家重點實驗室，江蘇 連云港 222001

采用UPLC-Q/TOF-MS技術對大鼠ig金振口服液后的血漿、尿液、膽汁和糞便中的原型成分及代謝產物進行分析，描繪金振口服液體內代謝輪廓，初步揭示其體內物質基礎。采用Waters ACQUITYTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液（A）-0.1%甲酸乙腈溶液（B）進行梯度洗脫，體積流量0.4 mL/min，柱溫40 ℃。電噴霧離子源（ESI），centroid 模式進行數據采集。基于高分辨質量虧損過濾技術，建立5步檢識策略來表征金振口服液在大鼠體內的相關外源物。大鼠ig金振口服液，在生物樣本中共檢識112個外源性成分，包括44個原型成分（22個成分經對照品比對）和68個代謝產物，主要的代謝途徑為II相代謝葡萄糖醛酸化、硫酸化及I相代謝甲基化等。采用UPLC-Q/TOF-MS技術及建立的檢識策略可對金振口服液在大鼠血漿、尿液、糞便和膽汁中的外源物進行快速有效的定性檢識，有助于揭示其體內藥效成分，為其藥動學特征的描繪及建立與功效相關聯的質量控制方法提供一定的參考依據。

金振口服液；UPLC-Q/TOF-MS；原型成分；代謝產物；黃芩苷；甘草苷

金振口服液（Jinzhen Oral Liquid，JZOL）為江蘇康緣藥業股份有限公司獨家產品，由山羊角、大黃、黃芩、平貝母、人工牛黃、石膏、青礞石、甘草8味中藥組成，已列為國家中藥保護品種[1]。方中山羊角、黃芩、平貝母為君藥，其中山羊角具有解熱、鎮靜和抗驚厥的功效，黃芩通腹泄肺熱，平貝母清熱散結、化痰止咳；大黃、石膏、人工牛黃為臣藥，大黃瀉熱通腑，使肺之痰熱由下而解，生石膏瀉火、化痰，協助君藥清泄肺熱，人工牛黃降溫、化痰、止咳、平喘；青礞石為佐藥，墜痰下氣，平肝定驚；甘草為使藥，和中緩急，調和諸藥；諸藥合用，共奏清熱解毒、去痰止咳的功效[2]。金振口服液臨床上主要用于治療小兒急性支氣管炎符合痰熱咳嗽者[3-4]，表現為咳嗽、咳吐不爽、咳吐黃痰、發熱、舌質紅、苔黃膩。其療效可靠、不良反應少、服用方便、依從性高，是我國兒童醫療保險品種，被譽為治療小兒肺熱咳嗽的妙藥[5]。

前期采用UPLC-Q/TOF-MS技術描繪了JZOL的整體化學輪廓，共檢識鑒定了90余個化學成分，總結了不同結構類型化合物的色譜行為和碎片裂解途徑，為金振口服液藥效物質基礎研究提供了參考。到目前為止，JZOL在臨床試驗、藥理學和質量控制等領域都進行了大量的研究[6-8]。其中，JZOL中組方藥味及相關單體化合物的代謝研究報道較多[9-14]，為JZOL體內代謝產物的分析和鑒定奠定了一定的基礎。然而，對于口服JZOL后外源性成分的入血情況及其在大鼠體內的生物轉化的報道甚少，給藥效的深入研究、臨床安全用藥及質量標準的進一步提升造成了一定的困難。因此，有必要對JZOL進行全面地體內代謝產物表征。本實驗采用超高效液相色譜與飛行時間質譜聯用技術（UPLC-Q/TOF-MS），建立一種快速有效的JZOL在大鼠體內外源性成分及代謝途徑的分析方法，為其藥動學特征描繪及其質量標準提升奠定基礎，也為JZOL深入的藥理活性研究及進一步開發利用提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器設備

超高效液相色譜四級桿飛行時間質譜聯用儀：色譜系統為Waters ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜儀，Waters ACQUITYTMI-Class超高效液相色譜儀（包括二元梯度泵-自動進樣器-柱溫箱-二極管陣列檢測器）；質譜系統為Waters SYNAPTTMG2 Q/TOF HDMS四級桿串聯飛行時間高分辨質譜（Manchester，U.K.）；Waters ACQUITYTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；Sartorius BP 211D型電子天平（德國Sartorius公司）；KQ3200E型超聲波清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）；Anke TGL-16G-A型高速離心機（上海安亭科學儀器廠）；Sigma臺式高速冷凍離心機3K-15（德國Sigma公司）。

1.2 試劑與材料

質譜用水，北京屈臣氏蒸餾水有限公司；質譜級乙腈及甲醇，美國賽默飛世爾科技公司；質譜級甲酸，美國西格瑪奧德里奇公司；JZOL制劑，江蘇康緣藥業股份有限公司（批號201114）。甘草苷（批號110714-201711）、黃芩苷（批號110715- 201821）、大黃酸（批號110757-201607）、漢黃芩素（批號111514-201706）、膽酸（批號100078- 201415）、豬去氧膽酸（批號100087-201411）、去氧膽酸（批號110724-201808）、黃芩黃酮Ⅱ（批號111610-201908），以上均購自中國食品藥品檢定研究院；漢黃芩苷（批號BP1454）、異甘草素（批號BP0787）、千層紙苷（批號BP1046）、白楊素7--β--葡萄糖醛酸（批號BP3423）、(18β,20)-甘草酸（批號BP2052）、甘草次酸（批號BP0681），以上購自成都普瑞法科技開發有限公司；蘆薈大黃素-8--β--葡萄糖苷（批號DST141028-013）、甘草素（批號DST190920-010）、異甘草苷（批號DST190802-142），購自成都樂美天醫藥科技有限公司；甘草酸（批號B20417）、大黃酚-8--β--葡萄糖苷（批號B20239），購自源葉生物有限公司；貝母素乙（批號B20081-20），購自上海麥克林生化科技有限公司；甘草皂苷G2、甘草素二糖苷為課題組自制，所有對照品質量分數均大于98%。

1.3 動物

雄性SPF 級Sprague-Dawley（SD）大鼠，體質量（250±20）g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（京）2019-0008。動物房溫度（23±2）℃，濕度（55±10）%，大鼠每天接受光照12 h，自由飲水進食。動物實驗經暨南大學倫理審批（20220304-010）。

2 方法

2.1 動物實驗

2.1.1 大鼠ig溶液的配制 取10支JZOL（10 mL/支，共100 mL，批號201114），采用旋轉蒸發儀減壓濃縮至20 mL，作為JZOL大鼠ig溶液。

2.1.2 分組及給藥 大鼠實驗前適應性喂養1周，實驗前禁食不禁水12 h，隨機分成2組：給藥組（＝6）和對照組（＝4），給藥組大鼠ig給藥JZOL濃縮液7.576 g/(kg·d)（生藥量），對照組ig給予等量飲用水。連續ig 5 d，最后1 d ig后，分別采集大鼠0.5、1、2、4 h肝門靜脈血置于涂有肝素鈉溶液的2 mL EP管中，14 000 r/min離心10 min制備血漿樣本，合并各時間點血漿，?20 ℃冰箱保存備用。收集給藥后第3～5天的尿液和糞便；取最后1次給藥后0～8 h膽汁。

2.2 供試品溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取黃芩苷、漢黃芩苷、甘草苷、甘草酸、大黃酸、貝母素乙等對照品適量，加甲醇定容至10 mL，配制成各化合物終質量濃度為10 μg/mL 的混合對照品溶液。經14 000 r/min高速離心10 min后，取上清液進樣UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.2.2 JZOL樣品溶液的制備 取JZOL適量，經14 000 r/min高速離心10 min后，取上清液進樣UPLC-Q/TOF-MS分析。

2.3 體內樣品前處理

2.3.1 血漿樣品的制備 取100 μL血漿樣品于1.5 mL EP管中，加入400 μL冰乙腈沉淀蛋白，渦旋2 min，經14 000 r/min高速離心10 min后，上清液常溫下氮氣吹干，取100 μL甲醇復溶，渦旋2 min，14 000 r/min高速離心20 min，取4 μL上清液進樣UPLC-Q/TOF-MS分析。空白血漿樣品處理方法同上。

2.3.2 膽汁樣品前處理 混合不同時間段的給藥組膽汁樣本，取收集的膽汁樣本上樣于活化平衡后的SPE小柱，待其充分吸附后，先用3 mL 5%的甲醇-水溶液洗去極性大的雜質，再用3 mL純甲醇進行洗脫，收集純甲醇洗脫部位，在室溫下用氮氣吹干，殘渣用100 μL純甲醇復溶，經14 000 r/min高速離心20 min后，取4 μL上清液進樣UPLC-Q/TOF-MS分析。空白膽汁處理方法同上。

2.3.3 尿液樣品前處理 將不同時間段的給藥組尿液樣本混合，14 000 r/min高速離心10 min，上清液濃縮至6 mL，上樣于活化平衡后的SPE小柱，每次1 mL，重復6次。其他處理步驟同膽汁樣品。空白尿液樣本按同種方法處理并進樣分析。

2.3.4 糞便樣品前處理 混合給藥組的糞便樣本，風干。干糞便樣本（1 g）粉碎成粉末后置錐形瓶中，加入10 mL純甲醇，浸泡24 h后，超聲提取30 min，過濾取上清液，經14 000 r/min高速離心10 min后，上清液常溫下氮氣吹干，殘渣用1 mL純水復溶后，上樣于活化平衡后的SPE小柱，其他處理步驟同膽汁樣品。空白糞便處理方法相同。

2.4 UPLC-Q/TOF-MS條件

2.4.1 色譜檢測條件 Waters ACQUITYTMBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；柱溫40 ℃；體積流量0.4 mL/min；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈（B）。洗脫梯度：0～13 min，50% B；13～16 min，50%～100% B；16～17 min，100% B；17～18 min，100%～5% B。

2.4.2 質譜檢測條件 電噴霧離子化源（ESI），離子源毛細管電壓正離子模式3.0 kV，負離子模式?2.5 kV，錐孔電壓正離子模式35 V，負離子模式為40 V。二級錐孔電壓4 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，脫溶劑氣體積流量600 L/Hr，在MSE模式中，低能通道碰撞能6 eV，高能通道碰狀能20～50 eV。質譜掃描范圍為/50～1500，以甲酸鈉溶液校正質量軸，以亮氨酸腦啡肽為內標校正質量精度，LockSprayTM體積流量5 μL/min。數據采集為centroid 模式。

閉式熱水系統壓力膨脹罐的選型需結合具體熱水系統經計算后選定，同一系統熱水回水溫度設定值不同則所需壓力膨脹罐的體積也不同且差距明顯。用水點多的大型熱水系統壓力膨脹罐體積較大，在熱水設備房專業提資時需充分考慮其安裝位置。

2.5 數據采集及分析技術

數據采集應用Waters Masslynx 4.1質譜控制平臺，在MSE模式下采集分析樣本總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）。目標物篩選應用基于MDF技術的Waters MetabolynxTM數據處理軟件。高分辨質量虧損過濾技術（mass defect filter，MDF）是指一個化合物的準確分子質量和該化合物的整數質量之間的差值，是一項隨著高分辨質譜技術的發展而誕生的一種技術[15]。數據處理參數設置如下：分析窗口0～16 min，質量殘差過濾窗口設置±70 mDa，代謝物質量數波動窗口0.02；代謝物與空白樣本匹配保留時間波動范圍±0.4 min；峰面積大于10倍以上，以甲基化等常見代謝反應設置質量虧損數據庫[16]。

3 結果與分析

采用“2.4”項的UPLC-Q/TOF-MS條件，在正、負離子模式下，對JZOL、給藥組及空白組生物樣本（血漿、尿液、糞便、膽汁）進行檢測分析。課題組前期對JZOL的化學成分進行快速檢識，根據復方的檢識結果，以空白大鼠生物樣本作為對照，共檢識到112個大鼠體內外源物。其中原型成分共44個（22個成分經對照品準確指認，結構見圖1），代謝產物共68個（數據見表1，離子色譜提取圖見圖2、3），TOF-MS的測得值與理論值比較，精確質量數的誤差均小于1×10?5。

3.1 JZOL吸收成分及代謝產物分析策略

采用5步策略法表征igJZOL后大鼠體內相關外源物。（1）根據前期對JZOL化學成分表征所建立的化學成分數據庫，通過比較其保留時間和碎片離子確定原型成分。（2）基于MDF技術處理篩選大鼠生物樣本中的潛在代謝物。JZOL中的成分可以根據其不同的基本骨架劃分為幾個類型，其中同源成分是在其基本結構上被不同的取代基取代[17]。因此，這一步最關鍵是確定幾個具有代表性的結構，以便于JZOL在體內的代謝產物分析。（3）基于文獻檢索，從文獻中尋找代表性化合物的代謝反應和特征碎片離子。（4）與空白生物樣品的對比，找出潛在代謝物。（5）識別和確認大鼠生物樣本中代謝物的分子離子和碎片離子。綜上，本實驗將五步策略法應用于描述JZOL在大鼠體內的代謝特征。

3.2 原型成分的鑒定

在給藥組（JZOL）的大鼠血漿、尿液、糞便和膽汁中鑒定出44個原型成分（22個成分經對照品比對），包括21個黃酮類成分、6個三萜類成分、6個膽烷酸類成分、5個生物堿類成分、4個蒽醌類成分、2個有機酸類成分。其中來源于血漿中29個、尿液中34個、膽汁中7個、糞便中20個（圖1和表1）。

通過對比空白與含藥樣品色譜峰的保留時間及質譜數據，并結合對照品及JZOL化學成分的質譜裂解規律，對JZOL體內原型成分進行了鑒定，其色譜圖如圖3所示。P6的準分子離子為[M－H]?/431.098 0，確定分子式為C21H20O10，二級碎裂給出碎片離子為[M－H－Glc]?/269.045 0，[M－H－Glc－CH2O]?/239.035 2，通過與對照品比對，鑒定P6為蘆薈大黃素-8--β--葡萄糖苷。

P23的準分子離子為[M－H]?/459.092 4，確定分子式為C22H20O11，脫去葡萄糖醛酸形成碎片離子[M－H－GluA]?/283.060 4，再脫去CH3形成/268.036 6，通過與對照品比對并結合文獻報道[16]，P23鑒定為漢黃芩苷。化合物P14（R＝6.06 min）、P18（R＝7.34 min）在負離子模式下質譜圖中顯示出相同的準分子離子峰[M－H]?/445.077 7，確定分子式為C21H18O11，MSE高能圖中均給出脫掉1分子葡萄糖醛酸形成的特征碎片離子[M－H－GluA]?/269.045 0。此外，P18檢識到碎片峰[M－H－GluA－2CO－H2O]?/195.045 8。P14在血漿、尿液及膽汁中檢出，經對照品比對，確定為黃芩苷。經過裂解規律分析及課題組前期體外檢識結果對比[18]，化合物P18確定為去甲漢黃芩素-7--β--葡萄糖醛酸，在血漿、尿液及糞便中均有檢出。

*表示經對照品準確指認

表1 大鼠生物樣品中JZOL原型及代謝產物的UPLC-Q/TOF-MS數據

續表1

續表1

P-原型成分 M-代謝產物；P、U、B和F代表血漿、尿液、膽汁和糞便樣本；*與對照品比較；gluA-葡萄糖醛酸化結合；sul-硫酸化結合

P-prototypes M-metabolites; P, U, B and F represent plasma, urine, bile and fecal samples; *compared with the reference substance; gluA-glucuronide; sul-sulfate

圖2 漢黃芩苷和黃芩苷可能的代謝途徑

通過查閱文獻、與對照品比對保留時間及碎片信息等，共準確指認了包括甘草素二糖苷、異甘草素二糖苷[16,19]等在內的22個原型成分。

3.3 代謝物的鑒定

基于策略第3步，定義了6個化合物為代表結構，涵蓋了JZOL的主要化學結構類型（黃酮、三萜、生物堿、蒽醌）：甘草苷、黃芩苷、漢黃芩素、甘草酸、貝母素乙、大黃酸。將6種代表性結構的分子式輸入Metabolynx XS軟件，分別進行了處理。通過對軟件處理預測所得潛在的代謝產物進行分析，最終在ig JZOL后的大鼠的生物樣本中共檢識到68個JZOL相關的代謝物，包括30個黃酮類成分，23個生物堿類成分、9個蒽醌類成分和6個三萜類成分（表1和圖3～5，圖4為部分代表性代謝產物色譜和碎片離子譜圖）。將甘草苷的分子式（C21H22O9）輸入Metabolynx XS軟件計算后發現，其主要發生的代謝反應包括還原、甲基化、葡萄糖醛酸化和硫酸酯化，基于MDF技術類似外源物篩選出來的結果進行抽提，通過代謝特征及文獻比對結果確定代謝產物。

甘草苷結構中含有1分子葡萄糖，在體內容易丟失葡萄糖，以苷元的形式存在[20]。代謝物M13準分子離子峰為[M－H]?/431.097 5，保留時間為3.74 min，分子式為C21H20O10，MSE模式下主要碎片離子為/255.065 3、135.008 8、119.049 1，且碎片離子/255.065 3為母離子丟失176（C6H8O6）產生，推測M13為甘草素的葡萄糖醛酸化代謝產物。同樣的，保留時間在6.23 min的色譜峰M36也為甘草素不同位點的葡萄糖醛酸化代謝產物。因此，判斷M13和M36分別為甘草素-7--β--葡萄糖醛酸苷和甘草素-4′--β--葡萄糖醛酸苷[20]。

P、U、B、F分別代表大鼠血漿、尿液、膽汁和糞便樣本；Pos和Neg分別表示正負離子模式；*表示經對照品準確指認的原型成分；Prot代表原型成分；Meta 表示代謝產物

M5、M24的準分子離子同為[M－H]?/335.023 1，確定分子式為C15H12O7S，脫去1分子硫酸酯基（80）形成[M－H－SO3]?/255.066 1碎片離子，與甘草素的準分子離子（/255.066 1）相同，且發生RDA裂解，形成/135.008 6與119.049 8的碎片離子，與甘草素裂解碎片相同，根據文獻報道[21]，甘草素經過硫酸酯結合代謝途徑形成甘草素-7--硫酸酯和甘草素-4′--硫酸酯，結合位點與葡萄糖醛酸化途徑相似，且前者保留時間先于后者，M5和M24的保留時間為3.10、4.36 min，綜合文獻報道[20]可判斷M5為甘草素-7--硫酸酯，M24為甘草素-4′--硫酸酯。

M4的準分子離子為[M－H]?/511.055 1，保留時間為3.03 min，確定分子式為C21H20O13S，脫去1分子葡萄糖醛酸（176）形成[M－H－GluA]?/335.023 2 的碎片離子，提示其為通過葡萄糖醛酸化代謝途徑所產生的代謝產物，又脫去SO3形成與甘草素準分子離子相同碎片離子，提示可能經過了硫酸酯結合代謝途徑，推測M3為甘草素的硫酸酯和葡萄糖醛酸結合物。

黃芩苷的準分子離子為[M－H]?/445.077 1，在體內易脫去葡萄糖醛酸，以其苷元黃芩素（/269.044 5）存在[22]，給藥后可在大鼠血漿中發現。黃芩素在體內易發生硫酸酯化反應，結合1分子硫酸酯基（80）形成準分子離子為[M－H]?/349.001 8 的硫酸化產物M16、M52。同時，再結合1分子葡萄糖醛酸（176）形成準分子離子為[M－H]?/525.033 9，葡萄糖醛酸化和硫酸酯化合物M8、M11、M33。M55、M58分別在8.27、9.04 min出峰，前者丟失176，后者丟失80均形成[M－H]?/283.060 7碎片離子，進一步丟失15（CH3）得到268.037 8，結合文獻推測[23]，M55、M58為黃芩素在體內甲基化后的葡萄糖醛酸化和硫酸酯化產物。

圖4 JZOL的主要代謝產物的MS色譜圖

圖5 JZOL在大鼠體內的代謝特征

漢黃芩苷（[M－H]?/459.092 7），在體內易脫去1分子葡萄糖醛酸形成漢黃芩素，M46的準分子離子[M－H]?/459.093 2與漢黃芩苷相同，其碎片離子為 [M－H－GluA]?/283.059 0，推測其為漢黃芩素-5--葡萄糖醛酸苷。漢黃芩素在體內易發生去甲基化反應，M59的準分子離子為[M－H]?/269.044 9，其碎片離子為[M－H－H2O]?/251.034 7，[M－H－CO]?/241.049 9，[M－H－CO－H2O]?/223.040 1，與漢黃芩素裂解規律相同，推測其為漢黃芩素丟失1分子甲基（14）后形成。M30為[M－H]?/635.124 4，確定分子式為C28H28O17，碎片離子/459.091 6，為母離子丟失葡萄糖醛酸（176）而形成，提示結構里含有1分子葡萄糖醛酸，碎片離子/283.060 6為/459.091 6脫去葡萄糖醛酸（176）形成，與漢黃芩素準分子離子相同，提示可能是經過葡萄糖醛酸化代謝途徑產生，推測M30為漢黃芩素的2分子葡萄糖醛酸結合形成的代謝產物（圖2）。

生物堿主要的活性成分為貝母素乙，生物堿類化合物在正離子模式下出峰，負離子下無響應。通過Metabolynx XS軟件對貝母素乙進行分析，發現其以I相代謝為主，易發生水合反應、還原反應和羥基化，相關代謝產物在血中幾乎無響應，主要存在于尿液和糞便當中。M1準分子離子為[M＋H]+/448.342 4，脫去1分子H2O得到/430.332 5，與原型成分貝母素乙的準分子離子相同。連續丟失2分子H2O，得到/412.320 3，判斷M1為貝母素乙的水合化產物。M15準分子離子為[M＋H]+/446.326 4，為貝母素乙的羥基化代謝產物。M45保留時間為7.18 min，準分子離子為[M＋H]+/416.316 0，脫去1分子H2O得到[M＋H－H2O]+/398.305 9，同時檢測到其他碎片[M＋H－2H]+/414.304 1，[M＋H－C18H26O2]+/141.102 6，符合貝母素乙的裂解規律，判斷M45為貝母素乙的去甲基化合物。

甘草酸分子結構中由1分子甘草次酸和2分子葡萄糖醛酸組成，在體內易丟失2分子葡萄糖醛酸而水解形成苷元[24]，以苷元的形式發生I相及Ⅱ相代謝反應，主要代謝產物能在血中檢出。M65的保留時間為13.41 min，準分子離子為[M－H]?/485.327 0，確定分子式為C30H46O5，其碎片信息為[M－H－C6H8O]?/389.270 0，推測該代謝物為甘草次酸羥基化產物。

蒽醌類主要的活性代表成分為大黃酸，大黃酸發生I相和II相代謝。I相代謝以甲基化、羥基化為主。M62的保留時間為10.40 min，準分子離子為[M－H]?/297.040 9，確定分子式為C16H10O6，其碎片信息為[M－H－CO2]?/253.051 7，[M－H－CO2－CO]?/225.055 1，與文獻報道的相同[24]，因此確定該代謝物為大黃酸甲基化產物。結合CH3后，極易發生II相代謝，得到葡萄糖醛酸化產物（M42）。II相代謝以葡萄糖醛酸化和硫酸化為主。M21保留時間為4.19 min，準分子離子為[M－H]?/362.981 2，脫去1分子硫酸酯基（80），得到[M－H－SO3]?/283.024 3碎片離子，與大黃酸的準分子離子相同，同時還檢測到碎片[M－H－SO3－CO2]?/239.034 7，[M－H－SO3－CO2－CO]?/211.039 5，可以判斷M21為大黃酸的硫酸酯結合物。

此外，文獻報道[25]大黃酸在體內易發生還原反應，還原成蒽酮類化合物（M64：大黃酸-9-蒽酮），大黃酸-9-蒽酮發生Ⅱ相代謝，結合SO3，準分子離子為[M－H]?/349.001 8（C15H10O8S）的硫酸酯結合物M56為大黃酸-9-蒽酮-8--硫酸酯。

4 討論

本研究采用UPLC-Q-TOF-MS技術結合五步分析策略法對JZOL大鼠ig后體內原型成分及代謝產物進行快速檢識，鑒定了112個源自JZOL的外源性成分，包括44個原型成分和68個代謝產物。其中，共29個原型成分和31個代謝成分被吸收入血。上述結果表明，JZOL吸收入血成分主要為黃酮類、三萜類和蒽醌類。在大鼠體內主要代謝反應類型為水合、羥基化、葡萄糖醛酸化及硫酸酯化等。

以黃芩苷為代表的黃酮類成分是JZOL的藥效成分。有研究表明黃芩苷及其衍生物具有抗氧化、抗炎、鎮痛、抗病毒等多種重要的藥理作用[21-24]，同時黃芩苷入血迅速，能在體內產生多種類型的代謝產物。本實驗通過與空白樣品的比較，共檢測到了5個黃芩苷相關代謝產物，與文獻報道基本一致，主要為黃芩苷葡萄糖醛酸化代謝物、黃芩素硫酸酯化代謝物、3個黃芩素葡萄糖醛酸和硫酸化代謝物[22]。本實驗中，平貝母的生物堿成分的相關原型在血中幾乎沒有檢出，其主要暴露于尿液中，這可能與生物堿類成分在血中的達峰時間較快，半衰期較短[26]，藥物成分經血液循環至腎小球中，隨尿液排出；另一種可能是由于JZOL作為一個復方制劑，藥味多，所含化學成分復雜，各個成分在吸收入血過程中可能形成競爭或協同作用，而未表現出與單味藥或單個成分相同的多種代謝途徑。基于上述研究結果，后期可以聚焦入血代表性活性成分，探究口服JZOL后，大鼠血漿中多成分藥動學特征，以揭示JZOL發揮臨床功效的體內潛在藥效物質。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Characterization of xenobiotics of Jinzhen Oral Liquid in rats based on UPLC-Q/TOF-MS

ZHANG Jia-ying1, LI Hai-bo2, LIU Ling-xian1, SHI Dan-feng1, WANG Zhen-zhong2, CAO Liang2, YAO Xin-sheng1, XIAO Wei2, YU Yang1

1.Institute of Traditional Chinese Medicine and Natural Products, Jinan University, Guangzhou 510632, China 2. State Key Laboratory of New-tech for Chinese Medicine Pharmaceutical Process, Kanion Pharmaceutical Co., Ltd., Lianyungang 222001, China

To study the prototypes and their metabolites in rat plasma, urine, bile and feces after intragastric administration of Jinzhen Oral Liquid (金振口服液, JZOL) by UPLC-Q/TOF-MS technique.A Waters ACQUITYTMBEH C18column (2.1 mm×100 mm, 1.7 μm) was used for gradient elution with mobile phase 0.1% formic acid aqueous solution (A) and 0.1% formic acid acetonitrile (B), and the flow rate was 0.4 mL/min, the column temperature was 40 ℃.Electrospray ion (ESI) source was applied for the qualitative analysis under the positive and negative ion modes.Data is collected in centroid mode.Mass defect filter (MDF) technique and a five-step strategy were established to characterize the related xenobiotics of JZOL in four biological samples of rats.A total of 112 xenobiotics were identified, including 44 prototype components and 68 metabolites, of which 22 prototype components were identified with reference substance.The main metabolic pathways were phase Ⅱ metabolic reactions (mainly including glucuronidation and sulfonation) and phase Ⅰ metabolic methylation, etc.The established five-step strategy based on UPLC-Q/TOF-MS technique can be used for the rapid and effective qualitative identification of the xenobiotics in rat plasma, urine, feces and bile after oral administration of JZOL, which would be helpful to reveal the effective components.It provides some reference for the characterization of pharmacokinetic characteristics and the establishment of quality control methods related to efficacy.

Jinzhen Oral Liquid; UPLC-Q/TOF-MS; prototypes; metabolites; baicalin; liquiritin

R284.1

A

0253 - 2670(2022)10- 2956 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.004

2021-12-06

江蘇省省級工業和信息產業轉型升級專項資金項目：多組分中藥研究關鍵技術；國家自然科學青年基金資助項目（81903426）

張嘉穎（1997—），女，廣東省韶關市人，碩士研究生，研究方向為中藥及天然藥物的活性成分研究。E-mail: 574487287@qq.com

通信作者：于 洋，副研究員，碩士生導師，研究方向為中藥及天然藥物活性成分研究。E-mail: 1018yuyang@163.com

肖 偉，研究員級高級工程師，博士生導師，中國工程院院士，研究方向為中藥及天然藥物活性成分研究。E-mail: xw_kanion@163.com

[責任編輯 王文倩]