人參固本口服液對小鼠股骨骨折術后認知功能的影響及機制探討

鐘彥亨，姚景春，孫成宏，張貴民，李法升, 2*

人參固本口服液對小鼠股骨骨折術后認知功能的影響及機制探討

鐘彥亨1，姚景春4，孫成宏4，張貴民3*，李法升1, 2*

1.暨南大學附屬第一醫院，廣東 廣州 510630 2.河源市深河人民醫院（暨南大學附屬第五醫院），廣東 河源 517475 3.魯南制藥集團股份有限公司，中藥制藥共性技術國家重點實驗室，山東 臨沂 276006 4.魯南制藥集團股份有限公司新藥藥理中心，山東 臨沂 276006

探討人參固本口服液對小鼠股骨骨折術后認知功能的影響及作用機制。60只C57BL/6小鼠隨機分為對照組、人參固本口服液（0.50 mL/只）組、手術組和手術＋人參固本口服液低、中、高劑量（0.05、0.10、0.50 mL/只）組。小鼠麻醉后制備骨折模型，各給藥組ig相應藥物；術后第3天，采用Morris水迷宮實驗記錄小鼠逃避潛伏期，Y迷宮檢測小鼠學習記憶次數，曠場實驗檢測其情緒行為；行為學完成后，小鼠處死取海馬組織，采用ELISA法檢測小鼠海馬區腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用qRT-PCR法測定海馬區B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）mRNA表達；采用TUNEL法檢測海馬神經元凋亡情況。與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組小鼠術后第3天的平均逃避潛伏期顯著縮短（＜0.05），學習記憶次數顯著減少（＜0.05），穿越次數顯著增加（＜0.05）；血清中TNF-α和IL-6水平明顯降低（＜0.05）；海馬區mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）；海馬組織神經細胞凋亡數顯著減少（＜0.05）。人參固本口服液能夠通過抑制炎癥反應，降低海馬神經元凋亡，從而改善小鼠股骨骨折術后認知功能障礙。

人參固本口服液；骨折；認知功能；炎癥反應；凋亡

術后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是發生在高齡患者術后的重要并發癥，可發生在不同類型的手術，常表現為意識、認知、記憶、定向、感知、運動行為等方面的功能障礙，往往預后不良，影響療效與遠期生存[1-3]。隨著社會老齡化，老年人髖部骨折的發生率呈上升趨勢，其中以股骨頸骨折和股骨轉子間骨折發病率最高，且具有極高的致殘率及死亡率[4]。目前，手術治療能夠有效降低病死率，促使患者早日恢復并減少并發癥發生，因此老年髖部骨折現多采取手術治療。但臨床觀察發現，老年患者髖部骨折術后常并發POCD，其發生率高達35%～65%[5]。對POCD相關因素的研究是對其病因和發病機制的一種探索，掌握危險因素可以對患者發生POCD的可能性進行預測，并提出有效的防治措施，有利于患者術后的早期功能鍛煉和康復。

人參固本口服液具有滋陰益氣、固本培元的功效。研究表明，人參固本口服液對小鼠有明顯的抗疲勞、耐缺氧作用，能夠提高小鼠腹腔內巨噬細胞的吞噬功能，同時提高機體免疫功能[6]。然而其在POCD中的作用尚未見報道。為明確人參固本口服液在POCD中的治療作用，本研究旨在考察人參固本口服液治療POCD的機制，為臨床治療POCD提供科學理論依據及實驗基礎。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠60只，18月齡，體質量20 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物合格證號210726211101477878，動物使用許可證號SYXK（粵）2017-0174。動物在暨南大學醫學院實驗動物中心飼養，飼養于無特定病原體環境，室溫保持在22～25 ℃，室內相對濕度為（55±5）%，遵循12 h/d光照、12 h/d黑暗周期，并保持給予充足的飼料和滅菌飲用水，手術前后6 h禁食禁水。動物實驗經暨南大學實驗動物倫理委員會批準（批準號20200902-09）。

1.2 藥品與試劑

人參固本口服液（10 mL/支，批號29190332）購自魯南厚普制藥有限公司；三溴乙醇（批號T48402）購自美國Sigma公司；凋亡檢測試劑盒（批號C10617）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號BMS607-3）、白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號BMS603-2）、動物總RNA快速提取試劑盒（批號K157002）購自美國Invitrogen公司；逆轉錄試劑盒（批號K1691）、qRT-PCR試劑盒（批號46610）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

骨折模型架（美國NYU Impactor ModelⅡ）；Morris水迷宮、Y迷宮（上海吉量軟件科技有限公司分析系統）；曠場實驗視頻分析系統（上海軟隆科技發展有限公司）；KDC-40型低速離心機（科大創新股份有限公司中佳分公司）；5810R型冷凍超速離心機（德國Eppendorf公司）；Varioskan LUX多功能酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PCR擴增儀（美國Bio-Rad公司）；倒置白光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

用隨機數字表法將小鼠隨機分為對照組、人參固本口服液（0.50 mL/只）組、手術組和手術＋人參固本口服液低、中、高劑量（0.05、0.10、0.50 mL/只）組，每組10只。手術組和手術＋人參固本口服液低、中、高劑量組大鼠麻醉后制備骨折模型；各給藥組ig相應藥物，對照組和手術組ig等體積生理鹽水，1次/d。

2.2 小鼠股骨骨折髓內固定模型的制備

小鼠ip三溴乙醇（13 μL/g）麻醉，仰臥位固定，右下肢以10%安爾碘消毒準備手術。取髕旁內側切口約3 mm，使髕骨脫位以暴露股骨髁間。以帶不銹鋼導針的26 G不銹鋼針，于股骨髁間開口并鉆入股骨髓腔，擴髓至股骨粗隆部，并將導針留于髓腔內。將帶導針的小鼠大腿置于骨折模型架的沖撞臺上，肢體平貼于臺兩側，根據3點折彎作用，打擊質量350 g，打擊高度6 cm，打擊深度為沖撞臺上1.5 mm，制造閉合性股骨骨折。經導針將26 G不銹鋼針插入骨折的股骨髓腔，行骨折髓內固定，剪斷鋼針柄，推進使尾部平齊股骨髁關節面。立即在X線下觀察，確定骨折類型。小鼠蘇醒后置于籠中飼養，并進行1周的抗生素喂養。

2.3 行為學分析

2.3.1 Morris水迷宮實驗記錄小鼠逃避潛伏期 骨折模型建立后第3天進行Morris水迷宮測試，觀察受試小鼠空間學習和記憶能力，記錄小鼠逃避潛伏期，確定小鼠術后認知功能的變化。具體操作如下：水迷宮為直徑100 cm、高30 cm的圓形水池，水深25 cm，水溫保持在（24±1）℃，水中加適量二氧化鈦粉末，使水渾濁。池壁上標有東南西北4個入水點，將水池等分為4個象限，水池第一象限正中處放1個直徑為10 cm、低于水平面0.5 cm的透明圓形平臺。迷宮上方安置帶有顯示系統的攝像機，用以同步記錄小鼠運動軌跡。迷宮外參照物保持不變，以供小鼠定位平臺。將小鼠面朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺的時間（逃避潛伏期）。如果90 s內找不到平臺，潛伏期記為90 s，并將小鼠置于平臺上休息30 s。訓練結束后，將小鼠置于籠中，并注意保暖，用電取暖器烘干鼠毛。

2.3.2 采用Y迷宮檢測小鼠學習記憶次數 Morris水迷宮測試完成后進行Y迷宮檢測。Y迷宮采用燈光和電刺激，使小鼠形成回避條件反射，通過觀察和記錄回避條件反射和空間辨別能力，來判斷小鼠的學習記憶和空間認知等方面的能力。Y迷宮由3個輻射式迷路箱（等長I、II、III臂，及3者交界區）和1個控制儀組成。學習訓練：設置電刺激參數，采取隨機休息模式，記錄其正確反應次數。觀察指標：所需訓練次數。所需訓練次數反映其回避條件反射盒空間分辨反應的學習成績，所需次數越少證明小鼠學習速度越快或學習能力越強。正確反映率反映記憶的保存能力，正確率高說明小鼠對信息的保持和提取能力較強。

2.3.3 采用曠場實驗檢測其情緒行為 開場裝置包括1個60 cm×60 cm的正方形地面以及四面的40 cm高的壁構成，中心區域定義為距離周壁大于15 cm的正方形區域。裝置的正上方有白色冷光源（4 W，距地面80 cm）。測試開始時，只打開此光源，將小鼠面向周壁放置到同一個角落，通過視頻追蹤系統記錄5 min內小鼠的活動情況。每只小鼠試驗結束后，用酒精擦洗清理裝置周壁和底面，清理干凈后進行下一只小鼠實驗，排除上一只小鼠殘留信息對本次測試結果的影響。開場實驗廣泛應用于評估動物焦慮以及探究行為，主要分別記錄5 min內小鼠在裝置中的水平、垂直方向的運動（包括在總區域，外周區和中間區的運動距離），評估小鼠于中心區域活動占總活動的百分比。

2.4 ELISA檢測小鼠海馬區的炎癥因子TNF-α和IL-6水平

行為學測試完成后，小鼠ip三溴乙醇（13 μL/g）麻醉，去除小鼠顱骨后分離其腦部組織，用冰凍生理鹽水灌洗腦部組織，迅速剝離覆蓋在海馬組織上的大腦皮層，暴露并取出小鼠海馬組織。海馬勻漿，于2～8 ℃、5000 r/min離心5 min，取上清液，采用ELISA試劑盒說明書測定TNF-α及IL-6水平。

2.5 qRT-PCR測定海馬神經元B淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）mRNA表達

通過動物總RNA快速提取試劑盒從海馬組織提取總RNA。然后，按照逆轉錄試劑盒進行cDNA合成。以18S rRNA作為內參，引物序列：上游引物5’-GCCGAAATGTTTGCTGACG-3’，下游引物5’-CCGATCTCGAAGGAAGTCCA-3’；上游引物5’-ACTTTGCCGAGATGTCCAGC-3’，下游引物5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3’；18S rRNA上游引物5’-GAAGGGCACCACCAGGAGT-3’，下游引物5’-CAGACAAATCACTCCACCAA-3’。最后，使用qRT-PCR試劑盒，進行PCR擴增反應，反應結束后，應用2???Ct法分析數據。

2.6 Tunnel法檢測海馬神經元凋亡情況

取小鼠海馬組織，于4%多聚甲醛中固定后進行石蠟包埋，將包埋后的海馬組織進行切片，厚度為5 mm。然后，將切片按照TUNEL凋亡檢測試劑盒說明書進行染色，DAB進行顯色。將染色好的標本置于顯微鏡下進行觀察，細胞核為棕黃色或棕褐色的細胞為凋亡細胞，每個標本取10個高倍視野（×400）記錄陽性細胞數，并計算平均值。

2.7 數據處理

3 結果

3.1 Morris水迷宮、Y迷宮和曠場實驗結果

如表1所示，人參固本口服液組與對照組小鼠術后第3天平均逃避潛伏期、平均學習記憶次數和中心區域活動占比比較，差異無統計學意義；與對照組比較，手術組小鼠術后第3天平均逃避潛伏期顯著延長（＜0.05），平均學習記憶次數顯著增加（＜0.05），中心區域活動顯著減少（＜0.05）；與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組術后第3天平均逃避潛伏期顯著縮短（＜0.05），平均學習記憶次數顯著減少（＜0.05），中心區域活動顯著增加（＜0.05）。

3.2 各組小鼠海馬區TNF-α和IL-6水平

如表2所示，對照組與人參固本口服液組小鼠海馬區炎癥因子TNF-α與IL-6水平相近，差異無統計學意義；與對照組比較，其余各組TNF-α與IL-6水平明顯升高（＜0.05）；與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區炎癥因子TNF-α與IL-6水平顯著降低（＜0.05）。

3.3 各組小鼠海馬神經元Bax和Bcl-2 mRNA表達

如表3所示，對照組與人參固本口服液組小鼠海馬區和mRNA表達水平相近，差異無統計學意義；與對照組比較，手術組小鼠海馬區mRNA表達水平顯著升高（＜0.05），mRNA表達水平顯著降低（＜0.05）；與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區mRNA表達水平顯著降低（＜0.05），mRNA表達水平顯著升高（＜0.05）。

表1 各組小鼠術后第3天的平均逃避潛伏期、學習記憶次數和中心區域活動占比(, n = 10)

Table 1 Average escape latency, number of learning and memory and percentage of activities in central area of mice in each group on 3rd day after surgery (, n = 10)

表1 各組小鼠術后第3天的平均逃避潛伏期、學習記憶次數和中心區域活動占比(, n = 10)

組別劑量/(mL·只?1)逃避潛伏期/s學習記憶次數/次中心區域活動占比/% 對照—21.97±3.2629.70±4.7810.60±2.19 人參固本口服液0.5020.75±3.6129.20±4.2810.82±2.23 手術—31.60±4.58#56.74±4.35#3.83±1.17# 手術＋人參固本口服液0.0532.78±10.8353.43±3.413.52±0.79 0.1031.07±4.1953.37±4.903.58±0.91 0.5024.67±2.96*41.73±3.36*7.65±0.88*

與對照組比較：#＜0.05；與手術組比較：*＜0.05，下表同

#< 0.05control group;*< 0.05surgery group, same as below tables

表2 各組小鼠海馬區TNF-α和IL-6水平(, n = 10)

Table 2 TNF-α and IL-6 levels in hippocampus of mice in each group (, n = 10)

表2 各組小鼠海馬區TNF-α和IL-6水平(, n = 10)

組別劑量/(mL·只?1)TNF-α/(pg·mL?1)IL-6/(pg·mL?1) 對照—253.04±13.611 689.52±129.67 人參固本口服液0.50251.42±15.211 833.47±132.81 手術—360.89±18.54#3 048.50±276.14# 手術＋人參固本口服液0.05338.73±18.153 013.45±238.26 0.10335.42±27.322 966.17±221.13 0.50316.81±21.12*2 730.03±256.74*

表3 各組小鼠海馬神經元Bax和Bcl-2 mRNA表達(, n = 10)

Table 3 Bax and Bcl-2 mRNA expressions in hippocampal neurons of mice in each group (, n = 10)

表3 各組小鼠海馬神經元Bax和Bcl-2 mRNA表達(, n = 10)

組別劑量/(mL·只?1)mRNA相對表達量 BaxBcl-2 對照—1.000±0.0201.000±0.015 人參固本口服液0.501.009±0.0111.012±0.019 手術—3.241±0.017#0.736±0.014# 手術＋人參固本口服液0.053.236±0.0150.732±0.012 0.103.001±0.0160.785±0.014 0.501.914±0.018*0.907±0.012*

3.4 各組小鼠海馬組織神經細胞凋亡情況

如圖1和表4所示，對照組與人參固本口服液組小鼠海馬組織神經細胞凋亡細胞數相近，差異無統計學意義；與對照組比較，手術組小鼠術后海馬組織神經細胞凋亡個數顯著增多（＜0.05）；與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組小鼠術后海馬組織神經細胞凋亡個數顯著減少（＜0.05），手術＋人參固本口服液低、中劑量組呈降低趨勢。

圖1 各組小鼠海馬組織神經細胞凋亡情況

表4 各組小鼠海馬組織神經細胞凋亡情況

4 討論

老年髖部骨折分為老年股骨頸骨折和老年股骨轉子骨折，以關節置換和髓內釘內固定為主要手術治療方式。臨床觀察發現，老年患者髖部骨折術后常并發POCD，其發生率高達35%～65%[5]。老年髖部手術的POCD發生使患者對于各種不良因素的反應減弱，更容易發生墜積性肺炎、下肢深靜脈炎、褥瘡等并發癥，間接影響手術的治療效果。大量臨床研究和動物實驗所證實，POCD的持續時間越長，遠期恢復效果越差。Edelstein等[7]對老年髖部骨折患者行手術治療，隨訪發現術后發生POCD的患者其住院時間延長，患肢功能恢復緩慢。Marcantonio等[8]報道發生POCD的患者的術后6個月死亡率是未發生患者的3倍。因此，本研究通過構建一種穩定的小鼠股骨骨折髓內固定的POCD模型，用以研究人參固本口服液對POCD的影響。

人參固本口服液是由人參固本丸改變劑型而成，具有補益元氣、固本培元的功效[6,9]。有研究表明，補益脾胃元氣方藥人參、洗心湯、大補元煎含藥腦脊液可拮抗腦組織β淀粉樣蛋白誘導的氧化應激，且其有效成分易透過血腦屏障，對大鼠海馬神經干/祖細胞活力與遷移能力具有促進作用[10]；補益脾胃元氣方藥對快速老化癡呆模型小鼠空間識別和學習記憶能力有明顯的改善作用，可能與人參皂苷Rg1密切相關[10-11]。本研究結果顯示，與對照組比較，手術組小鼠平均逃避潛伏期延長，學習記憶次數增加，穿越次數減少，表明股骨骨折髓內固定小鼠學習記憶功能受損，出現術后認知功能的改變。而手術＋人參固本口服液高劑量組較手術組平均逃避潛伏期縮短，平均學習記憶次數減少，平均穿越次數增加，提示高劑量人參固本口服液可明顯改善股骨骨折髓內固定小鼠的學習記憶功能損傷，其功能的改善可能與人參固本口服液中的人參皂苷密切相關。

目前普遍認為POCD的發生是在中樞神經系統衰老的基礎上由麻醉和手術刺激誘發，多種因素綜合作用的結果，而炎癥反應在其中發揮著重要的作用[12]。有研究發現在胃腸道大手術患者血清中IL-6顯著升高，且與POCD發生率相關[13]。Cibelli等[14]在動物實驗中發現手術可致外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α等水平升高，進而使與海馬相關的記憶受損。本研究結果顯示，與對照組比較，手術組血清中TNF-α與IL-6水平明顯升高，提示股骨骨折髓內固定可誘發強烈的無菌性炎癥反應；與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區炎癥因子TNF-α與IL-6水平降低，提示高劑量人參固本口服液可改善股骨骨折髓內固定老齡小鼠POCD，可能與降低海馬區炎癥反應有關。

Bcl-2家族蛋白在細胞凋亡調控中發揮著重要作用，Bcl-2是一種抑凋亡蛋白[15-16]，而Bax是促凋亡蛋白之一，兩者的表達含量及表達比率決定著細胞最終的生命走向[17-18]。本研究結果顯示，與對照組比較，手術組小鼠海馬區mRNA表達水平升高，mRNA表達水平降低，Bax/Bcl-2值升高，海馬組織神經細胞凋亡數明顯增多，提示手術造成小鼠海馬神經凋亡傾向增加；與手術組比較，手術＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區mRNA表達水平降低，mRNA表達水平升高，Bax/Bcl-2值降低，海馬組織神經細胞凋亡數減少，凋亡率降低，提示高劑量人參固本口服液可降低小鼠海馬神經凋亡的發生。

本研究表明，高劑量人參固本口服液可改善老齡小鼠股骨骨折POCD，可能與人參固本口服液中的人參皂苷通過降低炎癥因子TNF-α、IL-6水平，抑制炎癥反應，從而降低海馬神經元凋亡有關。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Ginseng Guben Oral Liquid on cognitive function of mice after femoral fracture operation

ZHONG Yan-heng1, YAO Jing-chun4, SUN Cheng-hong4, ZHANG Gui-min3, LI Fa-sheng1, 2

1.The First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, China 2.Shenhe People’s Hospital (The Fifth Affiliated Hospital of Jinan University), Heyuan 517475, China 3.State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Generic Technology, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 4.Center for New Drug Pharmacology, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China

To investigate the effect and mechanism of Ginseng Guben Oral Liquid (人參固本口服液, RSGB) on cognitive function of mice after femoral fracture surgery.Sixty C57BL/6 mice were randomly divided into control group, RSGB (0.50 mL/mice) group, surgery group and surgery + RSGB low-, medium- and high-dose (0.05, 0.10, 0.50 mL/mice) groups.Mice were anesthetized to prepare a fracture model, and each administration group was given corresponding drugs.On 3rd day after operation, escape latency of mice was recorded by Morris water maze test, learning and memory times of mice were detected by Y-maze, and emotional behavior of mice was detected by open field test; After behavioral study, mice were sacrificed and hippocampal tissue was taken.ELISA method was used to detect tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) levels in hippocampus of mice; qRT-PCR was used to determine the mRNA expressions of B-cell lymphoma 2 () and Bcl-2 associated X protein () in hippocampus; TUNEL method was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons.Compared with operation group, average escape latency of mice in operation + RSGB high-dose group was significantly shortened on 3rd day after operation (< 0.05), learning and memory times were significantly reduced (< 0.05), and crossing times were significantly increased (< 0.05); TNF-α and IL-6 levels in serum were significantly decreased (< 0.05);mRNA expression in hippocampus was significantly decreased (< 0.05), andmRNA expression was significantly increased (< 0.05); Number of apoptotic neurons in hippocampus was significantly decreased (< 0.05).RSGB can inhibit inflammatory response and reduce apoptosis of hippocampal neurons, thereby improving the cognitive dysfunction in mice after femoral fracture.

Ginseng Guben Oral Liquid; fracture; cognitive function; inflammatory response; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3078 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.018

2022-01-27

中藥制藥共性技術國家重點實驗室開放基金資助項目（202009）

鐘彥亨（1991—），男，碩士，醫師，研究方向為脊柱、創傷骨科疾病。Tel: (020)38688617 E-mail: 784826926@qq.com

通信作者：李法升（1989—），男，本科，主管技師，研究方向為骨科相關疾病的影像研究。Tel: 13802423266 E-mail: 412447633@qq.com

張貴民（1969—），男，研究員，研究方向為創新藥物研發研究。Tel: (0539)5030565 E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

[責任編輯 李亞楠]