淫羊藿素通過Akt/mTOR調控糖酵解抑制肝內膽管癌細胞增殖的作用機制研究

鄧冬杰，李 勵，談相云，孫 懿，王楚婷，鄭國華, 2，王桂紅*，胡俊杰*

淫羊藿素通過Akt/mTOR調控糖酵解抑制肝內膽管癌細胞增殖的作用機制研究

鄧冬杰1，李 勵1，談相云1，孫 懿1，王楚婷1，鄭國華1, 2，王桂紅1*，胡俊杰1*

1.湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065 2.湖北中醫藥大學中藥資源與中藥復方教育部重點實驗室，湖北 武漢 430065

探究淫羊藿素對人肝內膽管癌HuCCT1細胞增殖的影響及其作用機制。CCK-8法檢測淫羊藿素對HuCCT1細胞增殖活性的影響；平板克隆法檢測淫羊藿素對HuCCT1細胞集落形成能力的影響；流式細胞術檢測淫羊藿素對HuCCT1細胞周期的影響；分光光度法檢測淫羊藿素對HuCCT1細胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）生成量以及己糖激酶（hexokinase，HK）和丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性的影響；Western blotting法檢測淫羊藿素對HuCCT1細胞中增殖相關蛋白和蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路及糖酵解相關蛋白表達的影響；Western blotting檢測淫羊藿素對瞬時轉染基因質粒的HuCCT1細胞中Akt/mTOR及糖酵解相關蛋白表達的影響。淫羊藿素顯著抑制HuCCT1細胞的活力，并呈時間和劑量相關性；淫羊藿素呈劑量相關性地抑制HuCCT1細胞的集落形成（＜0.001）；淫羊藿素可以將HuCCT1細胞周期阻滯在G1期，并顯著降低增殖相關蛋白的表達水平（＜0.05）；淫羊藿素可以顯著降低HuCCT1細胞葡萄糖攝取量、乳酸生成量及ATP生成量（＜0.05、0.01、0.001）；淫羊藿素顯著抑制糖酵解相關酶（HK、PK）的活性以及蛋白表達水平（＜0.05、0.01、0.001）；淫羊藿素顯著降低磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）、磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）、磷酸化核糖體蛋白S6（phosphorylatedribosomal protein S6，p-RPS6）的蛋白表達水平（＜0.05、0.01）；淫羊藿素顯著降低基因過表達的HuCCT1細胞中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2的蛋白表達水平（＜0.05、0.01、0.001）。淫羊藿素能夠抑制HuCCT1細胞的增殖，其作用機制可能與Akt/mTOR信號通路調控的糖酵解途徑有關。

淫羊藿素；肝內膽管癌；增殖；糖酵解；蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白

肝內膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）是起源于肝內膽管上皮細胞的原發性惡性腫瘤，是繼肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）之后第2常見的肝惡性腫瘤，占原發性肝癌的10%～15%[1]。臨床上主要以藥物化療為主，吉西他濱聯合鉑類仍是治療ICC的一線選擇，但會使患者出現不良反應或產生耐藥性[2]。因此，尋找更加安全有效的藥物對臨床上治療ICC具有重要意義。

能量代謝的異常改變是腫瘤細胞的主要特征之一，這種代謝表型的特征是優先依賴有氧糖酵解產生能量[3]。有研究表明，抑制腫瘤糖酵解途徑可以有效抑制腫瘤細胞的增殖，甚至起到殺滅腫瘤細胞的作用[4]。同時，研究證實蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）可以促進糖酵解途徑中關鍵酶的表達，導致腫瘤細胞的葡萄糖攝取增強和糖酵解途徑異常活躍，增加能量供應，促使腫瘤細胞無限增殖[5-7]。以上結果表明，Akt/mTOR信號通路與糖酵解密切相關。因此，抑制Akt/mTOR信號通路調控的糖酵解途徑，降低腫瘤細胞的能量供應，可以成為治療ICC的有效策略。

淫羊藿素是從中藥小檗科植物淫羊藿中分離得到的異戊二烯類黃酮衍生物。研究發現，淫羊藿素可以通過誘導細胞周期阻滯、促進細胞凋亡和壞死、干預腫瘤相關信號通路、抑制血管生成等途徑對肝細胞癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌等多種癌癥起到抑制作用[8-12]。Li等[13]研究發現淫羊藿素可以抑制惡性膠質瘤細胞的糖酵解，減少細胞的葡萄糖消耗量和乳酸生成量，進而抑制腫瘤細胞的增殖。但是，目前關于淫羊藿素對ICC的調控作用尚未見報道。因此，本研究基于腫瘤糖酵解途徑，以人肝內膽管癌HuCCT1細胞為研究對象，探究淫羊藿素對HuCCT1細胞增殖的影響及其作用機制，為臨床開發治療ICC的藥物提供參考。

1 材料

1.1 細胞株

HuCCT1細胞購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

淫羊藿素（質量分數≥98%，批號PS001091）購自成都普思生物科技股份有限公司；Akt質粒（pT3-EF1α-HA-myr-AKT1）由美國加州大學Chenxin實驗室構建；Neofect轉染試劑（批號D210102）購自北京零客創智生物技術有限公司；RPMI 1640培養基（批號AG29546226）、0.25%胰蛋白酶（批號J200033）、青霉素和鏈霉素（批號J120017）購自美國Hyclone公司；PBS緩沖液（批號MA0015-Jul-29G）購自大連美侖生物技術有限公司；胎牛血清（批號2059461RP）購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒（批號KQ749）購自日本同仁化學研究所；結晶紫（批號SLBP0250V）購自美國Sigma公司；細胞周期試劑盒（批號EG20201109）購自廣州捷倍斯生物科技有限公司；葡萄糖氧化酶測定試劑盒（批號2021A1GE1011）購自北京普利萊基因技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號710N0317）、乳酸含量檢測試劑盒（批號20200612）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）含量檢測試劑盒（批號20211215）、己糖激酶（hexokinase，HK）活性檢測試劑盒（批號20211116）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性檢測試劑盒（批號20210610）購自北京索萊寶生物科技有限公司；M-PERTM哺乳動物蛋白抽提試劑（批號VI311347）、BCA蛋白定量試劑盒（批號SI251119）、ECL超敏化學發光液（批號VF304274）均購自美國Thermo Fisher Scientific公司；蛋白酶抑制劑（批號06021）、磷酸酶抑制劑（批號07121）均購自康為世紀科技有限公司；兔源磷酸化mTOR（phosphorylated mTOR，p-mTOR）單克隆抗體（批號ab109268）、兔源核糖體蛋白S6（ribosomal protein S6，RPS6）單克隆抗體（批號ab225676）均購自英國Abcam公司；兔源Akt多克隆抗體（批號10176-2-AP）、周期蛋白E1（Cyclin E1）單克隆抗體（批號11554-1-AP）、鼠源β-actin單克隆抗體（批號HRP-60008）購自Proteintech公司；兔源磷酸化Akt（phosphorylated Akt，p-Akt）單克隆抗體（批號13038）、兔源磷酸化RPS6（phosphorylated RPS6，p-RPS6）單克隆抗體（批號4858）、兔源HK1單克隆抗體（批號2024）、兔源HK2單克隆抗體（批號2867）、兔源PKM1單克隆抗體（批號7067）、兔源PKM2單克隆抗體（批號4053）、兔源增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）單克隆抗體（批號13110）、兔源Cyclin D1單克隆抗體（批號2978）、HRP標記的山羊抗兔IgG二抗（批號7074）、HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗（批號7076）購自美國CST公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠試劑盒（批號18D250）購自美國EpiZyme Scientific公司；其余試劑為分析純，水為去離子水。

1.3 儀器

MCO-15AC型CO2細胞培養箱（日本Sanyo公司）；VCX750型超聲波破碎儀（美國Sonics公司）；CKX31型倒置顯微鏡、TC20型細胞計數器（日本Olympus公司）；Trans-Blot TurboTM型全能型蛋白轉膜儀、Power Pac Basic型電泳儀、xMark型全波長酶標儀（美國Bio-Rad公司）；Centrifuge 5424R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；XB220A型分析天平（瑞士Precisa公司）；G-BOX型成像分析系統（英國Syngene公司）；Vortex-Genie2型漩渦混合器（美國Scientific Industries公司）；NovoCyte D2060R型流式細胞儀（艾森生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 淫羊藿素母液的配制

精密稱取淫羊藿素3.68 mg溶于2 mL DMSO中，配成濃度為5 mmol/L的淫羊藿素母液，經0.22 μm微孔濾膜濾過，避光保存于4 ℃，使用時用培養基稀釋。

2.2 細胞培養

HuCCT1細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

2.3 淫羊藿素對HuCCT1細胞存活率的影響

取處于對數生長期的HuCCT1細胞，以5000個/孔接種于96孔板中，設置藥物組、對照組（不含藥物）和空白組（只含空白培養基）。于培養箱中培養過夜后，藥物組加入一系列濃度梯度的淫羊藿素，對照組加入等體積的培養基。每個劑量設6個復孔。分別培養24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，繼續培養2 h后，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（）值，計算細胞存活率，并計算淫羊藿素給藥24、48 h的半數抑制濃度（50% concentration of inhibition，IC50）值，根據IC50值設置后續實驗的給藥濃度，設置低、中、高3個劑量。

細胞存活率＝(給藥－空白)/(對照－空白)

2.4 淫羊藿素對HuCCT1細胞集落形成能力的影響

取處于對數生長期的HuCCT1細胞，以1000個/孔接種于6孔板中，培養24 h。設置對照組（不加藥物）和低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 μmol/L）給藥組，每組設置3個復孔。培養14 d，每2天換液，直至形成肉眼可見的細胞克隆。棄去細胞培養液，用PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.5%結晶紫染色15 min，倒掉染液，放入清水中清洗干凈殘留在6孔板中的染液，瀝干水分。相機拍攝記錄每孔集落的大致情況，于顯微鏡下計數1 cm2正方格內細胞集落數（黏連在一起的多個細胞落算作多個，邊角處數上不數下，數左不數右），再乘以每孔的面積即為總的細胞集落數。

2.5 淫羊藿素對HuCCT1細胞周期的影響

取處于對數生長期的HuCCT1細胞，接種于直徑為5 cm的培養皿中，于培養箱中培養。待細胞生長至60%～70%時，吸棄舊培養基，加入PBS清洗2次。設置對照組（不加藥物）和低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 μmol/L）給藥組，每組設置3個復孔。給藥24 h后收集細胞，加入1 mL冰浴預冷的PBS重懸，離心沉淀細胞，棄去上清。加入1 mL在4 ℃冰浴預冷的70%乙醇重懸細胞，于4 ℃固定細胞2 h。離心沉淀細胞，棄去乙醇。每個樣品加入0.5 mL碘化丙啶染色液，緩慢并充分重懸細胞。錫箔紙包裹EP管避光，于37 ℃孵育30 min后采用流式細胞儀檢測。

2.6 淫羊藿素對HuCCT1細胞葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量的影響

細胞培養、實驗分組以及給藥濃度同“2.5”項下方法。給藥24 h后收集細胞，取少量細胞懸液于細胞計數器中計量細胞數。離心后收集細胞，按照試劑盒操作步驟，采用酶標儀分別在555 nm（葡萄糖）、570 nm（乳酸）、340 nm（ATP）處檢測值，計算葡萄糖消耗量、乳酸生成量和ATP生成量。

2.7 淫羊藿素對HuCCT1細胞HK和PK活性的影響

細胞培養、實驗分組以及給藥濃度同“2.5”項下方法。給藥24 h后收集細胞，取少量細胞懸液于細胞計數器中計量細胞數。離心收集細胞至EP管中，棄上清。按照試劑盒操作步驟，采用酶標儀檢測340 nm處的值，計算HK和PK的活性。

2.8 淫羊藿素對瞬時轉染Akt基因質粒的HuCCT1細胞中糖酵解相關蛋白表達的影響

取處于對數生長期的HuCCT1細胞，接種于10 cm培養皿中，設置對照組、模型組和淫羊藿素低、中、高劑量（12.5、25.0、50.0 μmol/L）組。待細胞生長至60%時，進行轉染實驗。先將基因質粒與不含血清的RPMI 1640培養基稀釋并充分混勻，在質粒稀釋液中加入Neofect轉染試劑（培養基∶質粒∶轉染試劑＝1 mL∶1 μg∶1 μL），輕輕混勻，室溫靜置15～30 min。將轉染復合物加入細胞培養基中，輕輕混勻，培養24 h后進行藥物干預。

2.9 淫羊藿素對HuCCT1細胞中Akt/mTOR信號通路、細胞周期、增殖以及糖酵解相關蛋白的表達

從細胞中分離出總蛋白，采用BCA蛋白檢測試劑盒檢測蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺電泳分離后，轉至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入Cyclin D1、Cyclin E1、PCNA、p-Akt、Akt、p-mTOR、p-RPS6、RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2和β-actin抗體孵育過夜；然后用TBST緩沖溶液清洗3次，每次10 min，室溫孵育二抗1 h后，用TBST緩沖溶液清洗3次，每次10 min。用ECL化學發光液反應，并于G-BOX成像分析系統獲得蛋白免疫印記圖。采用Image J軟件對圖像進行分析，以β-actin為內參，以相對灰度值表示目標蛋白的表達。

2.10 統計學方法

采用GraphPad Prism 7.0軟件對數據進行統計分析，計量資料以表示，兩組間均數采用檢驗比較，多組間均數采用One-Way ANOVA檢驗。

3 結果

3.1 淫羊藿素對HuCCT1細胞存活率的影響

如圖1所示，與對照組比較，淫羊藿素（40、60、80 μmol/L）組24、48 h的細胞存活率均明顯降低，并呈時間和劑量相關性，其IC50值為50.48 μmol/L。參考以上結果，故確定12.5、25.0、50.0 μmol/L作為淫羊藿素的給藥劑量，并選擇作用24 h作為淫羊藿素的給藥條件。

圖1 淫羊藿素對HuCCT1細胞存活率的影響(, n = 3)

3.2 淫羊藿素抑制HuCCT1細胞集落形成能力

如圖2所示，與對照組比較，淫羊藿素（12.5、25.0、50.0 μmol/L）組細胞克隆形成數均顯著降低（＜0.001），且呈劑量相關性，表明淫羊藿素能夠抑制HuCCT1細胞的集落形成能力，即抑制HuCCT1細胞的增殖。

3.3 淫羊藿素將HuCCT1細胞周期阻滯于G1期

不同濃度的淫羊藿素處理細胞24 h后，流式細胞儀檢測結果如圖3所示，與對照組比較，隨著淫羊藿素濃度的增加，處于G1期的HuCCT1細胞數量顯著增加（＜0.05、0.01），表明淫羊藿素可將HuCCT1細胞周期阻滯于G1期。隨后檢測了G1期的特異性周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E1以及增殖蛋白PCNA的表達水平，相比于對照組，淫羊藿素組細胞中Cyclin D1、Cyclin E1和PCNA的表達水平均有所降低，且高劑量更為顯著（＜0.05）。

3.4 淫羊藿素抑制HuCCT1細胞中葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量

如圖4所示，與對照組相比，淫羊藿素顯著抑制HuCCT1細胞的葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量（＜0.05、0.01、0.001），且呈劑量相關性。

圖2 淫羊藿素對HuCCT1細胞集落形成的影響(, n = 3)

圖3 淫羊藿素對HuCCT1細胞周期(A) 和細胞周期相關蛋白表達(B) 的影響(, n = 3)

圖4 淫羊藿素對HuCCT1細胞葡萄糖攝取、乳酸生成量以及ATP生成量的影響(, n = 3)

3.5 淫羊藿素抑制HuCCT1細胞中糖酵解相關酶的表達及活性

如圖5-A所示，與對照組相比，淫羊藿素給藥組中糖酵解途徑相關酶HK1、HK2、PKM1、PKM2的蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），表明淫羊藿素可以抑制糖酵解相關酶的表達水平。由于糖酵解進程不僅與酶的含量有關，也與酶的活力有關，因此進一步檢測了淫羊藿素對HuCCT1細胞糖酵解相關酶活力的影響。如圖5-B所示，淫羊藿素處理細胞24 h后，與對照組相比，HK和PK的活力均顯著降低（＜0.01），并呈劑量相關性。

圖5 淫羊藿素對HuCCT1細胞HK、PK蛋白表達(A) 及活性(B) 的影響(, n = 3)

3.6 淫羊藿素抑制HuCCT1細胞中Akt/mTOR信號通路的活化

如圖6所示，淫羊藿素處理細胞24 h后，與對照組相比，p-Akt、p-mTOR、p-RPS6蛋白表達水平均顯著降低（＜0.05、0.01），Akt、RPS6蛋白表達水平無明顯差異，表明淫羊藿素抑制HuCCT1細胞中Akt/mTOR信號通路的活化。

3.7 淫羊藿素抑制瞬時轉染Akt基因質粒的HuCCT1細胞中糖酵解相關蛋白的表達

為了進一步探究淫羊藿素調控HuCCT1細胞糖酵解的作用機制，對HuCCT1細胞進行瞬時轉染基因質粒來激活Akt/mTOR信號通路，并檢測其下游糖酵解途徑相關蛋白的表達。Western blotting結果如圖7所示，與對照組相比，瞬時轉染基因質粒的HuCCT1細胞模型組中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2等蛋白表達水平顯著升高（＜0.01、0.001），表明轉染基因質粒的HuCCT1細胞中Akt/mTOR信號通路被激活，并進一步促進其下游糖酵解相關蛋白的表達水平；與瞬時轉染基因質粒的模型組相比，不同濃度的淫羊藿素給藥24 h后，p-Akt、p-mTOR、p-RPS6、HK1、HK2、PKM1、PKM2等蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），表明淫羊藿素可以通過Akt/mTOR信號級聯來調控HuCCT1細胞的糖酵解途徑。

圖6 淫羊藿素對HuCCT1細胞中Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響(, n = 3)

圖7 淫羊藿素對瞬時轉染Akt質粒的HuCCT1細胞中糖酵解相關蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

越來越多的證據表明，淫羊藿素是一種新型的抗癌藥物，可以通過多種途徑抑制腫瘤的發展[14]。Zhao等[9]發現淫羊藿素呈劑量和時間依賴的方式抑制肝癌PLC、PRF/5、Huh7細胞的活力，這種抑制活性是通過白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）/Janus激酶2（Janus kinase 3，JAK2）/信號轉導和轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路發揮作用的。在腎細胞癌細胞中，淫羊藿素可降低Cyclin D、CyclinE1等增殖相關蛋白的表達[15]。同時，在三陰性乳腺癌中，淫羊藿素也可以通過抑制雌激素受體-α36（estrogen receptor-α36，ER-α36）介導的有絲分裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/細胞外調節蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）信號傳導和雌激素對Cyclin D1的誘導來抑制腫瘤細胞增殖[16]。本研究結果表明，淫羊藿素呈時間和劑量依賴性地抑制HuCCT1細胞的活性，并有效抑制HuCCT1細胞的克隆形成。流式細胞術結果表明，淫羊藿素能將HuCCT1細胞的周期阻滯于G1期，并降低HuCCT1細胞中Cyclin D1、Cyclin E1的表達水平。然而具體的調控機制尚不清楚，因此在后續研究中進行了進一步探索。

腫瘤細胞中葡萄糖代謝的主要特征為葡萄糖攝取量增加和有氧糖酵解[3]。盡管有氧糖酵解在ATP凈產量方面不如氧化磷酸化，但其產能快捷，可以滿足腫瘤細胞對快速增殖的能量需求[17]。同時，腫瘤細胞也會通過增加葡萄糖攝取來促進糖酵解途徑。高水平的糖酵解為腫瘤細胞的無限增殖快速提供了能量，而此過程中產生的中間產物也成為了促進腫瘤增殖的誘因。糖酵解途徑關鍵酶的表達水平增強或活性增加是腫瘤細胞糖酵解途徑異常活躍的主要原因之一[4]。HK作為糖酵解過程中的重要限速酶，可以將進入細胞的葡萄糖轉化為6-磷酸-葡萄糖（glucose 6-phosphate，G6P），在多種癌癥中表達異常升高[18]。PK是糖酵解過程最后一步的標志性限速酶，負責將細胞質中的磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）和二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）轉化為丙酮酸鹽和ATP以促進腫瘤生長[19-20]。該酶在多種腫瘤進展中起著至關重要的作用，其中的1個亞型PKM2在ICC中高表達，因此被作為ICC的預測標志[21-22]。本研究發現，淫羊藿素可以顯著降低HuCCT1細胞中葡萄糖攝取量、乳酸生成量以及ATP生成量，并且也可以降低HK、PK的酶活力。同時，不同濃度的淫羊藿素給藥干預后，HuCCT1細胞中糖酵解相關蛋白HK1、HK2、PKM1、PKM2蛋白的表達水平顯著降低。以上結果說明淫羊藿素可以降低HuCCT1細胞糖酵解相關酶的表達水平及活力，抑制糖酵解途徑，減少葡萄糖攝取量、乳酸生成量和ATP生成量。另外，有研究表明，調控腫瘤細胞的糖酵解，可以使細胞周期相關蛋白表達升高，刺激腫瘤細胞增殖[23]。說明淫羊藿素可能通過調控細胞的糖酵解，阻斷腫瘤細胞能量供應，誘導細胞周期阻滯，從而有效抑制ICC細胞快速增殖。

研究發現，Akt/mTOR信號傳導途徑在調節糖酵解過程中發揮重要作用[24]。Akt是腫瘤糖酵解表型的重要驅動因素，并通過增加葡萄糖轉運蛋白的表達和膜易位以及磷酸化關鍵糖酵解酶來調控糖酵解[25]。同時，Akt可被磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）磷酸化而激活，活化的Akt可以激活下游的關鍵效應分子mTORC并可與Raptor結合形成mTOR復合物1。mTORC1可以磷酸化p70核糖體蛋白S6激酶進而激活RPS6來促進蛋白質合成用于腫瘤細胞增殖[2]。另外，活化的mTORC1也可以通過調控下游的轉錄因子影響糖酵解相關酶的表達水平[25]。本研究發現淫羊藿素可以降低HuCCT1細胞中p-Akt、p-mTOR、p-RPS6等Akt/mTOR信號通路相關蛋白的表達水平，因此推測淫羊藿素可能通過Akt/mTOR調控HuCCT1細胞的糖酵解途徑。為了進一步探究淫羊藿素是否是通過Akt/mTOR信號級聯來調控HuCCT1細胞糖酵解抑制其增殖。本研究在HuCCT1細胞中瞬時轉染基因質粒激活Akt/mTOR信號級聯，并通過Western blotting檢測Akt/mTOR信號通路以及其下游的糖酵解相關蛋白的表達水平。結果表明，在HuCCT1細胞中，Akt/mTOR信號級聯激活后可以使其下游的HK1、PKM1、HK2、PKM2等糖酵解關鍵蛋白的表達水平顯著升高。而在采用淫羊藿素干預24 h后，HuCCT1細胞中糖酵解相關蛋白的表達水平顯著降低。這說明淫羊藿素可以通過Akt/mTOR信號級聯調控HuCCT1細胞糖酵解，進而抑制其增殖。

綜上所述，本研究結果表明淫羊藿素可能通過抑制Akt/mTOR信號通路，阻斷細胞糖酵解，限制腫瘤細胞能量供應，將細胞阻滯于G1期，進而抑制肝內膽管癌細胞增殖。今后將進一步結合體內實驗深入研究淫羊藿素的作用機制，為淫羊藿素治療肝內膽管癌的藥物研究開發提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of icaritin on inhibiting proliferation of intrahepatic cholangiocarcinoma cells by Akt/mTOR-mediated glycolysis

DENG Dong-jie1, LI Li1, TAN Xiang-yun1, SUN Yi1, WANG Chu-ting1, ZHENG Guo-hua1, 2, WANG Gui-hong1, HU Jun-jie1

1.School of Pharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2.Key Laboratory of Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, Ministry of Education, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

To investigate the effect and mechanism of icaritin on proliferation of human intrahepatic cholangiocarcinoma HuCCT1 cells.CCK-8 method was used to detect the effect of icaritin on proliferation activity of HuCCT1 cells.Plate cloning method was used to detect the effect of icaritin on colony formation ability of HuCCT1 cells.Flow cytometry was used to detect the effect of icaritin on cell cycle of HuCCT1 cells.Spectrophotometric method was used to detect the effect of icaritin on glucose uptake, lactate production and adenosine triphosphate (ATP) production of HuCCT1 cells and activities of hexokinase (HK) and pyruvate kinase (PK) in cells.Western blotting was used to detect the effect of icaritin on expression levels of proliferation-related proteins, protein kinase B (Akt)/mammalian target of rapamycin (mTOR) pathway and glycolysis-related proteins in HuCCT1 cells.Western blotting was used to detect the effect of icaritin on expression levels of Akt/mTOR and glycolysis-related proteins in HuCCT1 cells transiently transfected withplasmids.Icaritin significantly inhibited the viability of HuCCT1 cells in a time-and dose-dependent manner.Icaritin significantly inhibited the colony formation of HuCCT1 cells in a dose-dependent manner (< 0.001).Icaritin blocked cell cycle of HuCCT1 in G1phase, and significantly reduced the expression levels of proliferation-related proteins (< 0.05).Icaritin significantly reduced glucose uptake, lactate production and ATP production in HuCCT1 cells (< 0.05, 0.01, 0.001).Icaritin significantly inhibited the activities of glycolysis-related enzymes and protein expression levels (< 0.05, 0.01, 0.001).Icaritin significantly reduced the expression levels of phosphorylated Akt (p-Akt), phosphorylated mTOR (p-mTOR) and phosphorylated ribosomal protein S6 (p-RPS6) (< 0.05, 0.01).Icaritin significantly reduced the expression levels of p-Akt p-mTOR, p-RPS6, HK1, HK2, PKM1 and PKM2 in HuCCT1 cells over-expressinggene (< 0.05, 0.01, 0.001).Icaritin can inhibit the proliferation of HuCCT1 cells, and its mechanism may be related to Akt/mTOR-mediated glycolysis pathway.

icaritin; intrahepatic cholangiocarcinoma; proliferation; glycolysis; protein kinase B/mammalian target of rapamycin

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3061 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.016

2022-01-18

湖北省自然科學基金資助項目（2020CFB523）

鄧冬杰（1997—），女，碩士，研究方向為中藥新制劑、新劑型的研究。Tel: 15926974750 E-mail: 1819493671@qq.com

通信作者：胡俊杰（1984—），男，博士，高級實驗師，主要從事中藥物質基礎及作用機制研究。 Tel: 13407126284 E-mail: hero0712@163.com

王桂紅（1964—），女，碩士生導師，主任藥師，主要從事中藥新制劑、新劑型的研究。Tel: 18986026269 E-mail: 843773585@qq.com

[責任編輯 李亞楠]