基于建立成分活性權重函數的當歸酒炙工藝評價研究

王 瑩，孫嘉辰，李 霞，高文遠, 4*

基于建立成分活性權重函數的當歸酒炙工藝評價研究

王 瑩1，孫嘉辰2，李 霞3，高文遠3, 4*

1.太原科技大學化學與生物工程學院，山西 太原 030024 2.天津商業大學，天津 300134 3.天津大學天津市現代藥物傳遞及功能高效化實驗室，天津 300072 4.青海民族大學藥學院，青海 西寧 810007

考察文火120 ℃和中火150 ℃酒炙當歸的過程中成分與凝血酶抑制活性隨時間的變化規律，建立成分與活性的權重函數，確定最佳酒炙工藝。采用HPLC對樣品中阿魏酸、5-羥甲基糠醛、對香豆酸、-藁本內酯、咖啡酸、綠原酸、山柰酚、香草醛、原兒茶酸、香草酸、茴香醛11種成分進行定量分析，采用凝血酶抑制活性測定樣品的活血活性，決定系數（2）表示單體化合物的貢獻率。在炮制12～28 min的過程中，阿魏酸、綠原酸、香草醛、5-羥甲基糠醛和藁本內酯的含量均先增加后降低，其他6種成分的含量沒有明顯的變化趨勢。120 ℃制備的酒當歸凝血酶抑制活性高于150 ℃制備的樣品，藁本內酯的貢獻率最高（2＝0.643 2），其次為阿魏酸。成分群和凝血酶抑制活性的權重函數為W＝ 2.6351＋107.2004－40.85011。確定了120 ℃炮制20 min為最佳炮制工藝，驗證了傳統炮制中采用文火炮制的科學性，建立了一種能夠通過簡單測試初步評估當歸及其炮制品整體質量的方法。

當歸；酒炙；凝血酶抑制活性；權重函數；活血活性；阿魏酸；5-羥甲基糠醛；對香豆酸；-藁本內酯；咖啡酸；綠原酸；山柰酚；香草醛；原兒茶酸；香草酸；茴香醛

當歸為傘形科植物當歸(Oliv.) Diels的干燥根，具有補血活血的功效，可用于調經止痛，廣泛應用于中藥配伍[1]。酒當歸的活血作用增強，作為當歸的主要炮制品被歷版《中國藥典》收錄。酒當歸的品質與其炮制溫度及炮制時間息息相關，在傳統炮制理論中，將炮制分為文火（80～120 ℃）、中火（120～150 ℃）和武火（220 ℃）[2]。當歸中揮發性成分含量較高，《中國藥典》及各省飲片炮制標準中酒當歸均采用文火炮制。中藥飲片多成分、多靶點的特征使其質量標準難以參考化學藥的標準建立，即僅通過一種有效成分難以實現質量標準與生物效價的統一。中藥飲片中多成分之間的互相影響也導致了量效關系的復雜性[3]。因此，選擇中藥飲片的活性成分群，開展活性成分-藥效的綜合評價，才能更好地評價中藥飲片的生物有效性。

目前，酒炙工藝的關鍵參數仍缺乏數據化，采用文火炮制的科學性沒有得到證實，同時缺乏成分-藥效集于一體的質量評價。因此，本實驗主要考察酒當歸在文火120 ℃和中火150 ℃炮制時成分及凝血酶抑制作用隨炮制時間的變化，建立成分-藥效的權重函數，闡明炮制機制，為建立科學的質量評價標準奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC/6310 MS高效液相色譜-質譜聯用，美國安捷倫科技公司；HPLC-PAD，島津LC-2030C 3D系統控制器；Sunrise酶標儀，瑞士Tecan公司；RE-200A型旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；CP225D型十萬分之一電子分析天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；SN2105T型電磁爐，美的集團有限公司；KQ-500E型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；H1650型離心機，湖南湘儀有限公司；ZNHW型智能恒溫數顯電熱套，上海弘懿儀器設備有限公司。

1.2 材料

對照品葡萄糖（批號110833-201205）、沒食子酸（批號110831-201204）、藁本內酯（批號111737- 201305）、阿魏酸（批號110773-201614）、綠原酸（批號110753-201415）、咖啡酸（批號110885-200102）、香草酸（批號110776-200402）、香草醛（批號100491-201902）、原兒茶酸（批號110809-201205）、對香豆酸（批號140711-200702）、山柰酚（批號110861-201310）、茴香醛（批號100147-200302）、5-羥甲基糠醛（5-HMF，批號111626-201308），質量分數均≥98%，購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、磷酸、冰醋酸、濃硫酸、苯酚、Na2CO3購自天津江天有限公司；色譜乙腈購自天津康科德公司；人原凝血酶、發光底物S-2238、福林酚購自美國Sigma-Aldrich公司；黃酒購自浙江塔牌紹興酒業有限公司。

當歸飲片，批號YN-1-1，購自甘肅天士力中天飲片廠，經天津大學生藥學科蘇艷芳教授鑒定為傘形科當歸屬植物當歸(Oliv.) Diels新鮮根莖的炮制加工品，經檢測符合《中國藥典》2020年版質量要求。

2 方法與結果

2.1 酒當歸樣品的制備

取當歸飲片2份（各1000 g），各噴灑黃酒100 g并拌勻，悶潤1 h[1]。置于炒藥鍋中，溫度分別設置為120 ℃和150 ℃，預熱后炒制，在炮制12～28 min時每2 min取出約30 g樣品，置晾藥盤內放涼。每個樣品平行制備3份，粉碎機分別粉碎后，過60目篩，常溫保存，備用。

2.2 總酚酸含量的測定

2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取樣品粉末0.1 g，加入5 mL 70%甲醇，超聲提取30 min，放冷，離心，殘渣再加入5 mL 70%甲醇，超聲提取30 min，放冷，離心后合并上清液。上清液用70%甲醇定容于10 mL量瓶中，搖勻后4 ℃保存，用于總酚和11種單體化合物的測定。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱定沒食子酸對照品適量，加70%甲醇超聲溶解，配制質量濃度為0.4 mg/mL的溶液，分別精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL置于1 mL量瓶中并用70%甲醇定容，搖勻備用。

2.2.3 測定方法 參考Chen等[4]建立的方法進行總酚含量的測定。取對照品溶液（50 μL）和Folin- Ciocalteau試劑（15 μL）混勻，3 min后加入Na2CO3溶液（10%，75 μL）和蒸餾水（100 μL）混勻后靜置20 min，于765 nm處測定吸光度（）值。70%甲醇溶液作為空白對照。以沒食子酸對照品質量濃度為橫坐標（），值為縱坐標（）繪制標準曲線，得回歸方程為＝0.042 3＋0.068 7，2＝0.996 7。樣品測試方法同上，結果以沒食子酸當量表示。制備的酒當歸樣品中總酚含量多高于當歸。在炮制溫度為120 ℃和150 ℃時，總酚含量均隨炮制時間的增加先升高后降低，分別在炮制22 min和24 min時含量最高，如圖1-a所示。

2.3 總多糖含量的測定

2.3.1 供試品溶液的制備 準確稱取樣品粉末0.5 g，置圓底燒瓶中，加蒸餾水20 mL，加熱回流1 h并濾過，如上操作重復提取1次，合并2次濾液置于50 mL量瓶中，并用蒸餾水定容，搖勻備用。

2.3.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥后的葡萄糖對照品10 mg，加蒸餾水溶解并定容到100 mL量瓶中。搖勻后分別精密量取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL置于1 mL量瓶中，加蒸餾水定容，搖勻，備用。

圖1 120 ℃和150 ℃當歸酒炙過程中總酚(a) 和總多糖(b) 含量的變化

2.3.3 測定方法 供試品溶液稀釋100倍后按照苯酚-硫酸法進行總多糖含量的測定[4]，用蒸餾水配制6%苯酚溶液。取葡萄糖對照品溶液20 μL，6%苯酚溶液20 μL和濃硫酸100 μL混勻后在70 ℃水浴中保溫10 min，冷卻后于490 nm處測定值，蒸餾水作為空白對照，以葡萄糖對照品質量濃度為橫坐標（），值為縱坐標（），繪制標準曲線，得回歸方程為＝0.005 9＋0.024 7，2＝0.998 8，樣品總多糖含量按回歸方程計算。當歸酒炙過程中總多糖含量的變化趨勢如圖1-b所示。炮制溫度為120 ℃和150 ℃時，酒當歸中總多糖含量均隨炮制時間的增加先升高后降低，在炮制18 min時含量最高，炮制時間超過24 min時含量低于當歸樣品。

2.4 化合物的定性和定量測定

2.4.1 化合物的定性分析 采用Agilent 1200 HPLC/6310 MS高效液相色譜-質譜聯用儀結合文獻報道對“2.2.1”項中制備的當歸70%甲醇提取物定性分析，質譜為電噴霧離子源，分別在正離子（3.0 kV）和負離子（?2.5 kV）模式下掃描：噴霧氣壓0.20 MPa，樣品錐孔電壓30 V，毛細管電壓4.0 kV，離子源溫度100 ℃，干燥氣溫度300 ℃，質量范圍/100～1000，梯度洗脫條件與HPLC相同。通過LC-MS結合文獻報道[5-7]對當歸中化學成分進行定性分析，總離子流圖如圖2-a、b所示，分析結果如表1、2所示。LC-MS正離子模式大致推斷出19個化合物可能的結構信息，主要為揮發油類；負離子模式大致推斷出19個化合物可能的結構信息，主要為酚酸類；阿魏酸在正、負離子模式下均出峰。

2.4.2 11種單體化學成分的定量分析

（1）供試品溶液的制備：為“2.2.1”項中制備的70%甲醇提取物。

（2）對照品溶液的制備：取11種對照品適量，精密稱定，分別置于棕色量瓶中，加70%甲醇制成藁本內酯、阿魏酸、綠原酸、咖啡酸、香草酸、香草醛、原兒茶酸、對香豆酸、山柰酚、茴香醛、5-羥甲基糠醛質量濃度分別為0.167、0.235、0.286、0.342、0.333、0.165、0.146、0.299、0.370、0.166、0.260 mg/mL的溶液，保存于4 ℃，備用。

（3）測定方法：按照陳健等[8]建立的方法進行定量分析。采用島津LC-2030C 3D系統，配備Kromasil 100-5 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相，梯度洗脫：0～10 min，3%乙腈；10～20 min，3%～10%乙腈；20～35 min，10%～20%乙腈；35～70 min，20%～30%乙腈；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL/min；在280、316 nm波長處同時檢測。

圖2 當歸70%甲醇提取物負離子(a)和正離子(b)模式下的總離子流圖

表1 MS/MS負離子模式鑒定當歸中化學成分

表2 MS/MS正離子模式鑒定當歸中化學成分

當歸樣品在波長為280、316 nm時的HPLC圖譜如圖3所示。采用外標法對其中的11種化學成分進行定量分析。文火和中火2個炮制溫度下，阿魏酸、綠原酸、香草醛、5-HMF和藁本內酯的含量均先增加后降低，如圖4-a、b所示。對香豆酸、咖啡酸、山柰酚、香草酸、原兒茶酸、茴香醛6種成分在120、150 ℃炮制過程中含量沒有很明顯的變化趨勢，如圖4-c、d所示。

2.5 凝血酶抑制活性的測定

2.5.1 供試品溶液的制備 精密量取“2.2.1”項中制備的70%甲醇提取液5 mL，置于50 ℃旋蒸蒸干后，準確量取50 μL DMSO溶解置于5 mL量瓶中，加入蒸餾水清洗并定容，搖勻后備用。

1-5-羥甲基糠醛 2-原兒茶酸 3-茴香醛 4-綠原酸 5-香草酸 6-咖啡酸 7-對香豆酸 8-阿魏酸 9-山柰酚 10-Z-藁本內酯 11-香草醛

圖4 阿魏酸、香草醛、綠原酸(a)及5-HMF、Z-藁本內酯(b)在炮制過程中含量的變化以及對香豆酸、咖啡酸、山柰酚、香草酸、原兒茶酸、茴香醛在120 ℃(c)和150 ℃(d)炮制過程中含量的變化

2.5.2 測定方法 按照Chuang等[9]建立的方法，用0.9% NaCl水溶液配制凝血酶（1 mg/mL）及發光底物S-2238（10 mg/mL），樣品倍數稀釋6個質量濃度。分別精確量取各質量濃度樣品溶液150 μL和凝血酶溶液30 μL加入96孔板中混勻。于25 ℃水浴中孵育10 min后加入75 μL S-2238溶液，繼續孵育10 min，于405 nm處測定其值。0.9% NaCl代替酶溶液作空白對照，抑制活性按公式（1）計算。

抑制率＝1－樣品/空白（1）

空白為空白對照溶液的值，樣品為當歸提取物的值

凝血酶抑制活性以pIC50［pIC50＝?lg(IC50×0.001)，IC50值為抑制率達到50%時，化合物的質量濃度］值來表示，結果如圖5所示。當歸的pIC50值為1.585，隨炮制時間的延長，酒當歸的pIC50值均先增加后減少，分別在炮制18 min和20 min時pIC50值最高。

圖5 當歸及120、150 ℃炒制過程中酒當歸的凝血酶抑制活性

2.6 綜合評價模型的建立

按照Chen等[10]建立的方法，以pIC50值最大的樣品作為陽性對照，通過2，及其他樣品中各化合物濃度與陽性對照樣品中該化合物質量濃度的比值計算得到權重（W）。以pIC50值為橫坐標，W為縱坐標作圖得到線性回歸方程，樣品中各成分的權重系數及加權方程如公式（2）所示。

W＝＝×pIC50＋（2）

2為權重系數，即單體化合物和凝血酶抑制活性的決定系數；C為各化合物質量濃度；C為凝血酶抑制活性最強的樣品中各化合物質量濃度；為化合物的個數

采用相關系數檢驗法對表3中化合物質量濃度與pIC50值擬合得到的一元線性方程進行回歸效果檢驗，樣品個數為19，α＝0.05時，阿魏酸、藁本內酯、茴香醛的質量濃度與pIC50值所得的經驗公式有意義。因此，權重與單體化合物質量濃度的關系如公式（3）所示。

W＝2.6351＋107.2004－40.85011（3）

1為阿魏酸質量濃度，4為藁本內酯質量濃度，11為茴香醛質量濃度

如表3所示，以pIC50值為橫坐標，W為縱坐標確定當歸樣品的凝血酶抑制活性綜合評價模型為W＝0.411 8 pIC50－0.579 9，2＝0.701 2（公式4）。權重與pIC50值的擬合方程相關系數＝0.837 4（＜0.01），說明得到的經驗公式有意義。已知當歸中藁本內酯、阿魏酸和茴香醛的質量濃度，可以通過公式（3）計算得到權重值，再用公式（4）計算樣品凝血酶抑制活性，即IC50值。

表3 化合物的質量濃度及權重與pIC50值的擬合方程

3 討論

3.1 總酚、總多糖含量變化分析

炮制過程中的高溫會破壞當歸的細胞結構使酚類物質不斷溶出，結合酚類發生水解成為游離酚使總酚含量增加[11]。酚類物質在持續的高溫下難以保持穩定的化學結構，如綠原酸和3,5-二咖啡酰奎寧酸均會被水解為咖啡酸[12]。結果表明，酒當歸中總酚含量高于當歸，150 ℃制備的酒當歸其含量低于120 ℃。

酒當歸的總多糖含量高于當歸，在2個炮制溫度下均隨炮制時間的增加先升高后降低，在炮制18 min時總多糖含量均達到最高，分別為25.89%和24.11%。以120 ℃炮制過程中總多糖含量隨炮制時間的變化趨勢為例進行分析，發現在炮制12 min時總多糖含量低于當歸，主要是由于細胞中半纖維素和木質素的結構不穩定發生降解，如橡木蒸制后總多糖含量下降，最高可下降36%[13]。在炮制12～18 min，總多糖含量隨炮制時間的延長而增加，主要是由于高溫使細胞壁被破壞而釋放出多糖[14]。長時間的高溫使多糖發生降解且部分多糖的碳化都會使多糖含量下降。在150 ℃炮制時更有益于多糖的快速溶出使得其總多糖的含量略高于120 ℃制備的酒當歸。

3.2 11種單體化合物的定量分析

在120、150 ℃炮制時，阿魏酸含量均先增加后降低。阿魏酸可與阿拉伯木聚糖形成酯鍵結合于細胞壁，加熱使酯鍵斷裂，游離的阿魏酸含量逐漸增加。同時，當歸中含有的阿魏酸松柏酯性質不穩定，高溫條件下易轉化為阿魏酸與松柏醇[15]。阿魏酸含量分別在炮制超過24、22 min時有所降低，說明繼續加熱其結構被高溫破壞。文獻報道阿魏酸在光照或升溫時均會發生降解[16]。

香草醛含量隨炮制時間的延長呈先升高后降低的趨勢，均高于當歸，是由于木質素在高溫時可降解生成香草醛。木質素最佳降解溫度為240～280 ℃[17]，因此150 ℃炮制時香草醛含量增加更快。綠原酸含量變化與前兩者有相同趨勢，其含量增加主要是結合態轉化為游離態，如大量的共軛酚和結合酚水解，而后的降低則是加熱過程中發生水解和分子內酯基的遷移而異構化[11]。

5-HMF是由葡萄糖或果糖在加熱過程中脫水生成的，因此含量會隨炮制溫度的升高和時間的延長而增加。在150 ℃炮制28 min時5-HMF含量降低，是由于其分子中含有的醛基和羥甲基可發生酯化、聚合和水解，分解為乙酰丙酸和甲酸[18]。藁本內酯的含量降低，主要是發生聚合反應形成了二聚體，而在炮制18 min時藁本內酯含量有一定增加，可能是二聚體水解[19]。

3.3 凝血酶抑制活性分析

隨著炮制時間的延長，酒當歸的pIC50值均先增加后減少，分別在炮制18、20 min時pIC50值較高，主要是由于此時阿魏酸及藁本內酯的含量均較高。120 ℃炮制條件下的酒當歸凝血酶抑制活性高于當歸，而150 ℃炮制條件下的酒當歸多低于當歸。文獻報道酒炙會減少總揮發油的含量，但是揮發油中藁本內酯的相對百分含量增加[19-20]。

從圖5可以看出對凝血酶抑制活性的貢獻率從高到低依次為-藁本內酯、阿魏酸，說明阿魏酸、藁本內酯是當歸活血作用的主要活性成分，茴香醛含量與凝血酶活性呈負相關性。其他8種化合物含量與凝血酶抑制活性的決定系數2均較小，沒有顯著相關性。姚藝新[21]通過灰色關聯度分析發現川芎中藁本內酯、洋川芎內酯和阿魏酸與活血活性之間有較高的關聯系數。

當歸具有補血活血的功效，酒炙后活血活性增強，與其酚酸類、多糖類成分相關。前期考察了多糖對凝血酶活性的影響，發現抑制率較低，而且可能是物理包埋作用，使得酶活位點難以發揮作用[22]。多糖的活血作用可能主要表現在提高造血能力、抗血小板聚集方面，需要進一步實驗驗證。本實驗考察了當歸及120、150 ℃分別炮制12～28 min制備的酒當歸共19個樣品的成分含量和凝血酶抑制活性的變化。本實驗驗證了傳統炮制中采用文火炮制的科學性，發現藁本內酯、阿魏酸是發揮活血作用的主要成分。炮制條件對于結合態阿魏酸到游離態的轉變，及阿魏酸松柏酯分解為阿魏酸均有較大影響，因此，僅以阿魏酸含量為指標難以完整地反映當歸整體質量特征。

本實驗解釋了炮制過程中主要成分含量和凝血酶抑制活性的變化規律，建立了成分與凝血酶抑制活性的權重函數，使通過測定成分含量來計算當歸及其炮制品的凝血酶抑制活性成為可能，解決了用1種小分子成分難以綜合評價中藥飲片質量的問題。通對藥效物質基礎的初步研究，為當歸和酒當歸質量的有效評價提供科學依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quantitative evaluation ofRadix processed with yellow wine based on composition-activity weight function method

WANG Ying1, SUN Jia-chen2, LI Xia3, GAO Wen-yuan3, 4

1.School of Chemical and Biological Engineering, Taiyuan University of Science and Technology, Taiyuan 030024, China 2.Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China 3.Tianjin Key Laboratory for Modern Drug Delivery and High-Efficiency, Tianjin University, Tianjin 300072, China 4.College of Pharmacy, Qinghai Minzu University, Xining 810007, China

To investigate the changes of ingredients and thrombin inhibitory activity in the process of wine-roasting Danggui () at 120 ℃and 150 ℃.The weight function of the ingredients and the activity was established, as well as the best roasting process was determined.Quantitative analysis of 11 components in samples, including ferulic acid, 5-hydroxymethylfurfural,-coumaric acid,-ligustilide, caffeic acid, chlorogenic acid, kaempferol, vanillin, protocatechuic acid, vanillic acid, and anisaldehyde, was carried out by HPLC.Thrombin inhibitory activity was used to evaluate the bioactivity of the samples.The values of determination coefficient (2) represented the contribution rate of compounds.During the processing of 12—28 min, the contents of ferulic acid, chlorogenic acid, vanillin, 5-hydroxymethylfurfural and-ligustilide increased first and then decreased, and the others had no obvious trend.Thrombin inhibitory activity ofwine-roasted at 120 ℃ was higher than that of the sample roasted at 150 ℃.The contribution rate of-ligustilide was the highest (2= 0.643 2), followed by ferulic acid.The weight function of compounds and thrombin inhibitory activity was shown asW= 2.6351+ 107.2004－40.85011.The best processing technology was wine-roasted for 20 min at 120 ℃, which verified the scientific of processing with gentle fire in the traditional method.This study established a simple method to evaluate the quality ofand its processed products in the first-level test.

(Oliv.) Diels; stir-frying with yellow wine; thrombin inhibitory activity; weighting function; blood activating activity; ferulic acid; 5-hydroxymethylfurfural;-coumaric acid;-ligustilide; caffeic acid; chlorogenic acid; kaempferol; vanillin; protocatechuic acid; vanillic acid; anisaldehyde

R283.1

A

0253 - 2670(2022)10 - 3014 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.011

2021-11-24

天津市科技計劃項目（19YFZSY00170）；青海省科技計劃項目（2021-SF-150）；來晉工作優秀博士獎勵基金（20212018）；太原科技大學科研啟動基金（20202067）；山西省高等學校科技創新項目（2021L337）

王 瑩（1988—），女，博士，研究方向為中藥炮制。Tel: 17835114050 E-mail: wangyingwangxing11@163.com

通信作者：李 霞，教授，博士生導師，主要從事中藥炮制、中藥化學研究。Tel: (022)87401895 E-mail: lixia2008@tju.edu.cn

高文遠，教授，博士生導師，主要從事中藥資源、中藥炮制、中藥化學研究。Tel: (022)87401895 E-mail: pharmgao@tju.edu.cn

[責任編輯 鄭禮勝]