三七總皂苷傳遞體中5種皂苷類成分含量與包封率的測定研究

范煜航，徐 暢#，費雅蓉，程碧欣，丘鷹昆，鄭杭生*

三七總皂苷傳遞體中5種皂苷類成分含量與包封率的測定研究

范煜航1，徐 暢1#，費雅蓉，程碧欣1，丘鷹昆2，鄭杭生1*

1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053 2.廈門大學藥學院，福建 廈門 361102

建立三七總皂苷（saponins，PNS）傳遞體（transfersomes，TFSs）（PNS-TFSs）中5種皂苷類成分含量與包封率的測定方法，并探討藥物包封特性。采用超高效液相色譜（UPLC）法測定PNS-TFSs制劑中三七皂苷R1（NGR1）、人參皂苷Rg1（GRg1）、人參皂苷Re（GRe）、人參皂苷Rb1（GRb1）與人參皂苷Rd（GRd）的含量，色譜柱為Hypersil Gold柱（100 mm×2.0 mm，1.9 μm），流動相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測波長為203 nm，柱溫為28 ℃。以離心超濾法結合UPLC測定傳遞體包封率。NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd對應的各色譜峰專屬性與分離度良好（≥1.5），且分別在4.04～505.00、3.98～498.00、4.03～504.00、3.99～499.00、4.00～500.00 μg/mL呈良好的線性關系（≥0.999 7），精密度（RSD≤2.40%）、準確度（97.23%≤回收率≤104.50%）與供試品溶液穩定性（RSD≤0.90%）均符合要求；測得PNS傳遞體中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd質量濃度依次為98.14、380.80、41.68、317.50、75.61 μg/mL，包封率依次為75.48%、69.68%、69.51%、92.35%、95.97%。UPLC法與離心超濾法可用于PNS傳遞體中多成分含量與包封率的測定，方法快速、準確、可靠。

三七總皂苷；傳遞體；超高效液相色譜；離心超濾法；包封率；包封特性；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rd

三七是五加科人參屬植物三七(Burk.) F.H.Chen的干燥根及根莖，是中醫傳統用于體內外各種出血之證及跌打損傷、瘀滯腫痛的要藥。其主要活性成分為三七總皂苷（saponins，PNS），PNS中主要成分包括三七皂苷R1（notoginsenoside R1，NGR1）、人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，GRg1）、人參皂苷Re（ginsenoside Re，GRe）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，GRb1）與人參皂苷Rd（ginsenoside Rd，GRd）等。PNS具有多種藥理作用，包括保護心腦血管系統、保護神經系統、抗腫瘤、抗菌、抗炎等[1]，并對骨折的愈合、骨關節損傷及肢體功能的恢復等也具有顯著療效[2]，同時，也被廣泛用于治療軟組織損傷[3]。目前，PNS臨床給藥方式主要為和iv，然而，容易引起胃腸道藥物分解，且存在肝首關效應，導致生物利用度低，而注射給藥存在患者順應性差、安全性等問題。此外，這2種給藥途徑均難以實現PNS在損傷局部組織分布，從而影響其治療局部損傷的作用。故在PNS的局部閉合性損傷治療中經皮給藥成為一種更具優勢的給藥途徑，因其可避免口服途徑存在的肝首過效應和胃腸道分解，用藥安全性高，給藥次數少，且可明顯提高PNS在用藥部位皮下局部組織的濃度，從而提高對局部疾病的療效[4]。然而，因PNS中各成分相對分子質量較大，難以透過角質層屏障，故需要設計合理的透皮給藥劑型以達到理想的經皮吸收效果。

傳遞體（transfersomes，TFSs）作為透皮給藥的優良載體，已受到廣泛的關注，它是由磷脂、膽固醇形成的雙分子層與邊緣活化劑（edge activator，EA）共同構成的可變形囊泡，后者的加入使TFSs具有良好的彈性和變形性，同時，由于天然存在的皮膚水化梯度的驅動作用，故TFSs能通過僅為其自身粒徑十分之一大小（被TFSs誘導擴張后）的皮膚角質層中的水性通道，到達皮膚深層部位[5]，其中部分包載的藥物釋放后被吸收入血而發揮全身作用，而另一部分藥物則可實現皮下較深部位的靶向遞送[6]。故在臨床上局部疾病的治療中，相較于其他給藥途徑，TFSs能夠增加皮下局部組織中的藥物濃度，并顯著降低進入體循環的藥量，從而發揮增效減毒的作用[7]。TFSs中常用的EA有膽酸鈉、聚山梨酯等表面活性劑。有研究發現，以檸檬烯與檸檬醛等單萜揮發油成分作為EA的TFSs具有相似的藥物經皮滲透特性[8]，本課題組前期研究結果也證實了以揮發油作為EA的TFSs可明顯促進藥物的透皮吸收與關節腔的局部藥物遞送[9-10]。

藥物包封率對于囊泡型藥物制劑的生物效應有重要影響，《中國藥典》2020年版四部微囊、微球與脂質體制劑指導原則中也明確規定脂質體制劑中藥物的包封率不得低于80%[11]，而TFSs是脂質體處方中加入EA后形成的脂質囊泡載體，其包封率的高低會影響經皮給藥后產生療效的優劣，故包封率亦為TFSs處方工藝篩選和質量評價的重要依據。為了提高PNS透皮與局部組織遞送效率，改善對局部閉合性損傷的療效，本課題組前期以單萜揮發油成分檸檬烯與檸檬醛作為EA將中藥有效部位PNS制備成傳遞體（PNS-TFSs）[12]。為了對該制劑進行更加全面、合理的質量評價，本實驗建立了一種同時測定PNS-TFSs中多種主要皂苷類成分含量的UPLC方法，并將離心超濾法與之結合，測定制劑中多種皂苷類成分的包封率，進而探討TFSs對PNS中皂苷類成分的包封特性。本研究可為PNS-TFSs制劑質量標準的建立與處方工藝的進一步優化奠定基礎。

1 儀器與試劑

H-class超高效液相色譜儀，美國Waters公司；Hypersil Gold C18液相色譜柱（100 mm×2.0 mm，1.9 μm），美國Thermo公司；R-502系列旋轉蒸發器，上海申生科技有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；SHB-111S型循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；XL2000型超聲破碎儀，美國Misonix公司；Nano-ZS90動態激光散射粒度儀，英國Malvern公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（TEM），日本Jeol公司；聚碳酸酯徑跡蝕刻膜，0.10、0.05 μm，英國Whatman公司；Olympus BX51型光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Homoe X-25型高壓膜擠出儀，上海赫默仕機電科技有限公司；BS124S型電子天平，德國薩多利斯公司；FE20型臺式pH計，梅特勒-托利多儀器有限公司；5804R型冷凍離心機，德國Eppendorf公司；Pall Nanosep離心濃縮管，截留相對分子質量10 000，美國Pall公司。

PNS，注射級，批號HB20081103，云南植物藥業有限公司；對照品GRg1（質量分數95.6%，批號110703-201426）、GRb1（質量分數96.1%，批號110704-201424）、GRd（質量分數96.3%，批號111818-201302）、GRe（質量分數95.7%，批號110754-201322）、NGR1（質量分數93.8%，批號110745-201015）均由中國食品藥品檢定研究院提供；大豆卵磷脂（sbPC），注射級，批號131002，上海太偉藥業有限公司；檸檬烯（批號140825，質量分數≥98.3%）與檸檬醛（批號141006，質量分數≥97.5%）均購自吉安市聚鵬天然香料油有限公司；膽固醇（CH），注射級，批號B40333，上海艾韋特醫藥科技有限公司；維生素E（VE），批號MKCD4493，Sigma公司；磷酸二氫鉀，分析純，批號20110801，溫州市化學用料廠；磷酸氫二鈉，分析純，批號130801，湖州湖試化學試劑有限公司；甲醇、二氯甲烷，分析純，均購自國藥集團化學試劑有限公司；乙腈，色譜純，美國Honeywell公司；UPLC用水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 PNS-TFSs的制備及物理性質表征

2.1.1 PNS-TFSs的制備 本課題組前期研究確定了采用薄膜分散法制備PNS-TFSs，并以TFSs的彈性為指標，通過均勻設計試驗得到優化處方與可行工藝[12]。本實驗參照相關處方工藝進行TFSs的制備。

分別配制0.067 mol/L磷酸二氫鉀溶液和0.067 mol/L磷酸氫二鈉溶液，兩者按124∶1的體積比混合，混合液稀釋10倍，即得需要濃度的pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液（PBS 5.0），作為薄膜分散法中脂質薄膜的水化液。

處方：PNS 100 mg、CH 30 mg、sbPC 120 mg、VE 2 mg、檸檬烯-檸檬醛（質量比4∶1）混合揮發油80 mg、PBS 5.0 10 mL。

工藝：按處方量稱取處方中除水化液之外的各組分，溶解于甲醇-二氯甲烷（3∶4）混合有機溶劑中，轉移至茄形瓶中，減壓旋轉蒸發除去溶劑，得到干膜，繼續旋轉蒸發2 h以除盡有機溶劑，加入水化液進行水化，靜置12 h后進行超聲破碎處理，最后依次擠壓通過0.10 μm與0.05 μm孔徑的聚碳酸酯徑跡蝕刻膜，即得PNS-TFSs。按相同處方工藝重復制備3批。

以同樣方法制備不含藥物PNS的TFSs，即得空白TFSs。

2.1.2 粒徑與ζ電位的測定 取適量PNS-TFSs樣品，以蒸餾水稀釋10倍后，在室溫下用激光散射粒度儀分別進行粒徑與ζ電位測定。所有樣品的各項測定均重復3次，結果PNS-TFSs的平均粒徑為（66.92±4.34）nm，多分散指數（PDI）為0.074± 0.016，平均ζ電位為（?25.1±1.5）mV（＝3），代表性粒徑與ζ電位分布圖見圖1。

圖1 PNS-TFSs的粒徑(A)和ζ電位(B)分布

2.1.3 顯微形態的觀察 對PNS-TFSs樣品進行適當倍數稀釋，吸取少量置于銅網正面，用濾紙吸去多余樣品液，用2%磷鎢酸溶液進行負染2 min，取出銅網，用濾紙吸取過多染液，將銅網正面朝上置于玻璃皿中，自然晾干，置于TEM下觀察并拍照。結果見圖2，樣品中的囊泡呈圓形或類圓形，大小及分布較均勻，粒子之間未見黏連與聚集現象。

圖2 PNS-TFSs的TEM圖

2.2 PNS-TFSs制劑中5種皂苷類成分含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil Gold C18柱（100 mm×2.0 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈-水，梯度洗脫：0～2 min，19%乙腈；2～12 min，19%～22%乙腈；12～12.1 min，22%～40%乙腈；12.1～17.4 min，40%～45%乙腈；17.4～17.5 min，45%～19%乙腈；體積流量為0.22 mL/min；進樣量為2.5 μL；柱溫為28 ℃；檢測波長為203 nm。

2.2.2 混合對照品儲備液的制備 分別精密稱取NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd對照品適量，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，搖勻，即得含5種成分的混合對照品儲備液，各成分質量濃度依次為0.505、0.498、0.504、0.499、0.500 mg/mL。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取PNS-TFSs 1 mL，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，用超聲波清洗器浴式超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理2 min，以甲醇定容，搖勻，用0.22 μm的有機相過濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.4 色譜峰的專屬性 分別取空白TFSs與PNS- TFSs樣品，按照“2.2.3”項下方法進行處理，得空白TFSs與PNS-TFSs的供試品溶液；精密稱取PNS 9.50 mg，按“2.2.2”項下從“置于10 mL量瓶中”開始進行配液，得PNS供試品溶液；另取“2.2.2”項下制備的混合對照品儲備液適量，稀釋適當倍數，得混合對照品供試品溶液。按照“2.2.1”項下色譜條件分別分析以上4份供試品溶液。色譜圖見圖3，由圖3可以看出，NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd各成分的色譜峰峰形良好，分離度（≥1.5）良好，空白傳遞體中的組分對各成分的色譜峰均無干擾。

2.2.5 線性關系考察 吸取“2.2.2”項下混合對照品儲備液，用甲醇逐級稀釋成不同質量濃度的對照品溶液系列，按照“2.2.1”項下色譜條件分別分析，記錄峰面積，以峰面積（）為縱坐標、各對照品質量濃度（）為橫坐標作圖，并進行線性回歸，得回歸方程依次為NGR1＝2.78－1.49（＝0.999 9，＝8）、GRg1＝3.21－1.92（＝0.999 8，＝8）、GRe＝3.30－2.56（＝0.999 8，＝8）、GRb1＝2.73－1.33（＝0.999 7，＝8）與GRd＝3.47－3.04（＝0.999 7，＝8），結果表明，NGR1、GRg1、GRe、GRb1、GRd分別在4.04～505.00、3.98～498.00、4.03～504.00、3.99～499.00、4.00～500.00 μg/mL呈良好的線性關系。

2.2.6 精密度試驗 在1 d內，分別取高、中、低3種質量濃度（200、20、10 μg/mL，按GRd計）的混合對照品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行分析，分別連續進樣6次，記錄峰面積，分別計算各成分在不同質量濃度下的RSD，以示日內精密度；在連續5 d內，高、中、低3種質量濃度的混合對照品溶液分別各進1次，記錄峰面積，分別計算各成分在各質量濃度下的RSD，以示日間精密度。結果見表1，NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd的RSD均小于3.0%，精密度符合要求。

1-NGR1 2-GRg1 3-GRe 4-GRb1 5-GRd

2.2.7 回收率試驗 精密量取空白TFSs樣品9份，每份1 mL，分別精密加入高、中、低（分別為1 mL樣品中各成分含量的80%、100%、120%[11]）3種不同質量的各測定成分對照品，各個質量分別平行3份，均按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，按“2.2.5”項下標準曲線進行定量，測得量相對于加入量的百分比為回收率，結果見表2，可見，該方法準確度良好。

表1 NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd精密度試驗結果

2.2.8 穩定性試驗 取PNS-TFSs樣品1份，按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，置于室溫下，分別在0、1、2、3、4、8、12 h，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，記錄各成分峰面積，分別計算NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd在不同時間點的RSD，結果依次為0.6%、0.9%、0.4%、0.7%、0.6%，結果表明供試品溶液中各待測成分在12 h內穩定。

表2 NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd回收率試驗結果 (, n = 3)

Table 2 Results of recovery test with NGR1, GRg1, GRe, GRb1 and GRd (, n = 3)

表2 NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd回收率試驗結果 (, n = 3)

加樣水平回收率/% NGR1GRg1GReGRb1GRd 低102.1±1.4102.2±1.9102.5±1.6103.5±1.099.5±1.2 中101.4±1.7101.8±2.199.8±1.0102.0±0.9101.0±1.1 高99.1±1.499.1±1.498.4±1.398.0±1.698.1±1.4

2.2.9 重復性試驗 取“2.1.1”項下PNS-TFSs混懸液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，平行6份，按照“2.2.1”項下色譜條件進行分析，按照“2.2.5”項下回歸方程進行定量測定。測得NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd各成分質量濃度的RSD分別為0.6%、0.5%、1.0%、0.5%、1.6%，結果表明該方法重復性良好。

2.2.10 PNS-TFSs中三七皂苷成分的含量測定 取“2.1.1”項下PNS-TFSs混懸液，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項下色譜條件進行分析，按照“2.2.5”項下回歸方程進行定量，平行3份。計算得各成分的質量濃度，結果見表3。

2.3 包封率的測定

2.3.1 離心超濾法測定PNS-TFSs的包封率 取“2.1.1”項下PNS-TFSs混懸液樣品，搖勻，取少量于光學顯微鏡下觀察，確認其中不含藥物結晶后精密量取100 μL，置于離心超濾管內，進行冷凍離心（離心力10 000×，溫度4 ℃），收集全部外水相，轉移至1 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項下色譜條件進行分析，測得PNS中各種成分的峰面積分別代入“2.2.5”項下的各種成分回歸方程以計算外水相中藥物含量；另外，取等量樣品，按“2.2.9”項下測定樣品中各成分的含量，并按下式計算包封率。

表3 PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd含量的測定結果(, n = 3)

Table 3 Content determination of NGR1, GRg1, GRe, GRb1 and GRd in PNS-TFSs (, n = 3)

表3 PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd含量的測定結果(, n = 3)

樣品質量濃度/(mg?mL?1) NGR1GRg1GReGRb1GRd 10.098±0.0010.381±0.0020.042±0.0010.318±0.0020.076±0.001 20.097±0.0020.378±0.0010.043±0.0060.320±0.0070.078±0.003 30.099±0.0130.379±0.0050.041±0.0040.319±0.0190.075±0.006

包封率＝(s－EA)/s

s為取樣量樣品中各成分的質量EA為取樣量樣品外水相中各成分的質量

2.3.2 超濾濾出液中的脂質體監測 采用2種方法監測濾出液中脂質體是否存在。①紫外分光光度法測定450 nm處樣品濁度；②光學顯微鏡觀察。其中，測定450 nm處樣品濁度時，合并多份濾出液以滿足測定體積要求。結果表明，濾出液中無脂質體存在。

2.3.3 超濾膜對溶液中游離藥物的吸附 取混合對照品儲備液，用PBS 5.0逐級稀釋成高、中、低3個不同質量濃度（500、100、20 μg/mL，按GRd計）各3份，每份500 μL，按“2.3.1”項中條件進行超濾，收集全部超濾液，轉移至1 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項下色譜條件分別測定超濾前溶液中PNS各成分對應的峰面積（before）與濾出液中PNS各成分對應的峰面積（after），計算超濾膜吸附率，結果見表4。可以看出，超濾膜對藥物吸附較小，超濾對藥物溶液質量濃度的影響可以忽略。

超濾膜吸附率＝(before－after)/before

2.3.4 稀釋對PNS-TFSs包封率測定結果的影響 取“2.1.1”項下PNS-TFSs混懸液樣品適量，分別用PBS 5.0稀釋1倍和2倍，得PNS-TFSs1/2、PNS-TFSs1/3。按“2.3.1”分別測定傳遞體PNS-TFSs、PNS- TFSs1/2、PNS-TFSs1/3的包封率，每份平行測定3次，結果見表5。可以看出，稀釋1倍后傳遞體中各成分的包封率均不同程度降低，稀釋2倍使傳遞體中NGR1、GRg1、GRe的包封率均降低20%以上，而GRb1和GRd即使稀釋2倍，包封率也在80%以上，下降較少。

表4 超濾膜對高、中、低質量濃度溶液中PNS各種成分的吸附結果(n = 3)

2.3.5 空白TFSs與PNS PBS溶液混合法制得TFSs的包封率 按如下處方（記作TFSsblank）：CH 30 mg、sbPC 120 mg、VE 2 mg、檸檬烯-檸檬醛（4∶1）混合揮發油80 mg、PBS 5.0 10 mL，以“2.1.1”項工藝條件薄膜分散法制備空白TFSs混懸液，將5 mL TFSsblank與20 mg/mL的PNS PBS溶液5 mL混勻，得TFSsblank+PNS。按“2.3.1”測定TFSsblank+PNS的包封率，平行測定3次，結果見表5。可以看出，TFSsblank+PNS的PNS各成分包封率均較高，只比PNS-TFSs低了不足15%。

2.3.6 PNS-TFSs包封率測定的方法重復性考察 按“2.3.1”項方法操作，將1份PNS-TFSs樣品平行測定6次，結果表明，NGR1、GRg1、GRe、GRb1、GRd各成分包封率的RSD分別為2.0%、0.6%、2.6%、0.1%、1.1%，說明該方法重復性良好。

表5 稀釋對包封率測定結果的影響及空白傳遞體與PNS PBS溶液混合制得脂質體的包封率

2.3.7 PNS-TFSs包封率的測定 按“2.3.1”項方法操作，將1份PNS-TFSs樣品平行測定3次，結果見表6。

表6 PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd包封率的測定結果

3 討論

中藥具有多成分、多靶點的特點，意味著通過單一成分控制很難全面評價其質量，需要對其進行多成分同時測定，然而，定量指標成分的增多，也相應地增加了檢測的周期和成本[13]。《中國藥典》2020年版一部中以NGR1、GRg1、GRe、GRb1和GRd為PNS含量測定的指標成分，采用HPLC法測定，需要60 min完成[14]，本課題組前期嘗試了藥典的條件，發現GRg1與GRe這2種成分無法達到完全分離[15]。因此，本實驗建立了一種可一次進樣同時測定PNS-TFSs中5種主要皂苷類成分的UPLC方法，該方法不僅可以實現這5種皂苷成分的良好色譜分離，且相較于HPLC法，UPLC法測定具有分析速度快、分離效率高、準確度與靈敏度高、溶劑使用少、廢液產生少等優點[16]，可以節約經濟成本與時間成本，同時更加環保。此外，測定結果與原料藥PNS的中各成分的含量比例基本一致，從一個方面佐證了結果合理、可信。

離心超濾法測定傳遞體包封率是將一定量傳遞體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉速下離心一段時間，游離藥物在離心力的作用下可通過超濾膜，而傳遞體則被超濾膜截留，從而實現二者的分離。而后收集濾液用于測定游離藥物的量，取等量未濾過的傳遞體測定藥物總量，計算包封率[17-18]。該方法快速，易于操作，且不需要復雜的設備，與其他技術（如超速離心）相比，它只需要少量的樣品。然而，離心超濾法有一個明顯的缺點就是藥物可能會被吸附在超濾膜上而引起損失，從而影響測定結果。因此，本實驗考察了超濾膜對高、中、低3個質量濃度溶液中游離PNS各成分的吸附，發現超濾膜對PNS各成分吸附均較小。

其次，超濾膜的選擇對于離心超濾法測定包封率也尤為重要，因過大或過小的濾孔均無法實現傳遞體與游離藥物良好分離。本實驗以離心超濾法結合UPLC法測定制劑的包封率，因PNS-TFSs平均粒徑約為67 nm，大多數皂苷成分的相對分子質量約為1000，對應分子尺寸為2～3 nm，故采用截留相對分子質量10 000（對應膜孔徑約為10 nm）的超濾膜進行冷凍離心，使PNS-TFSs中囊泡與游離藥物實現分離。

為了驗證超濾膜對于囊泡的分離效果，本實驗考察了2種監測濾出液中脂質體的方法，發現紫外分光光度法靈敏度較高，可用于檢測；光學顯微鏡只能觀察到大的脂質囊泡，難以觀察到一些小單室脂質體，靈敏度欠佳，但該方法簡便、快速，可用于囊泡初步監測。此外，定磷法是通過檢測濾出液中的磷的含量來監測濾出液中是否存在囊泡的方法，該法準確、靈敏[19]，但是本研究中TFSs制備時使用了PBS作為水化液，會對本法測定產生影響，故未采用。

離心超濾法是一種在平衡狀態下測定傳遞體包封率的方法，為了探究藥物與囊泡相互作用和藥物泄漏行為以及非平衡狀態對于PNS-TFSs包封率測定結果是否存在影響，將PNS-TFSs進行稀釋，發現在稀釋1倍和2倍后PNS-TFSs中各成分的包封率均有所降低，但GRb1與GRd的降低程度遠小于其他成分。除此以外，還發現空白傳遞體直接與PNS溶液混合載藥也具有較高的包封率，這可能與PNS中各成分良好的親脂性有關，這使得它們能較好地分配于雙分子層上。

為了探明傳遞體中5種皂苷的包封特性，運用軟件（ACD/Labs 10.0）進行了最優構象預測和基團間距離的計算，這樣可以綜合分析分子間親水基團之間的相互作用、疏水部分的相互作用與分子大小適應性等影響因素。sbPC雙分子層的厚度約5.0 nm，5種皂苷分子均含有1個親脂部分和2個親水部分，其中NGR1、GRg1與GRe的分子優勢構象均呈U形，2個親水端距離2.0 nm，親脂鏈長1.5 nm，故嵌入sbPC形成的雙分子層時因分子大小適應性差使系統能量很高，而GRb1與GRd的分子優勢構象為線型，2個親水端距離3.0 nm，親脂鏈長2.0 nm，嵌入磷脂雙分子層時，親脂部分大小合適，在雙分子層內部的糖基可相互作用，體系能量降低[20]。由上述結果可知，對于相對分子質量接近的不同皂苷分子，其優勢構象影響分子中親水基團之間的距離，進而影響分子與磷脂雙分子層的相互作用及藥物包封率，GRb1與GRd分子嵌入sbPC雙分子層產生的體系能量更低，表明兩者與sbPC雙分子層結合更穩定，這就解釋了與NGR1、GRg1、GRe相比GRb1和GRd為何具有更高的包封率（＜0.01），以及稀釋后包封率變化較小的原因。

此外，還發現一個大致的趨勢，即UPLC色譜分析保留時間越長的PNS成分，其對應在PNS-TFSs中包封率越高，也說明PNS成分親脂性與包封率存在一定相關性，即其親脂性越高，所對應的包封率越高，進一步地，可以推測PNS成分主要包封于PNS-TFSs的脂質雙分子層中。

本研究建立了一種同時測定PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1、GRd含量的UPLC法，此法精密、準確、快速，進而以離心超濾法結合UPLC測定PNS-TFSs多成分的包封率，方法簡便、準確、重復性良好，并根據實驗結果探討了PNS各主要成分在TFSs中的包封特性。本研究可以為單萜揮發油邊緣活化的PNS-TFSs的質量評價與處方優化提供參考，為其透皮研究的開展奠定實驗基礎。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Determination of contents and encapsulation efficiencies of five saponins insaponins transfersomes

FAN Yu-hang1, XU Chang1, FEI Ya-rong1, CHENG Bi-xin1, QIU Ying-kun2, ZHENG Hang-sheng1

1.School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2.School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China

To develop methods for the determination of contents and encapsulation efficiencies of five saponins insaponins (PNS) transfersomes (PNS-TFSs) and probe the drug encapsulation features.UPLC was adopted to determine the contents ofnotoginsenoside R1(NGR1), ginsenoside Rg1(GRg1), ginsenoside Re (GRe), ginsenoside Rb1(GRb1) and ginsenoside Rd (GRd) in the preparation of PNS-TFSs.An Hypersil Gold column (100 mm × 2.0 mm, 1.9 μm) was used to separate the analytes with acetonitrile-water mixture as the mobile phase in gradient elution mode, and the detection wavelength was set at 203 nm, the column temperature was 28 ℃.Encapsulation efficiencies were determined by centrifugal ultrafiltration method combined with UPLC.The specificity and resolution (≥ 1.5) of the peaks corresponding to each analyte met requirements of methodology.The calibration curves were linear (≥ 0.9997) and in the ranges of 4.04—505.00, 3.98—498.00, 4.03—504.00, 3.99—499.00, 4.00—500.00 μg/mL for NGR1, GRg1, GRe, GRb1and GRd respectively.RSD (≤ 2.4%) of repeated measurements with working solution of chemical reference substances (CRS) and recoveries (97.23%—104.50%) of the analytes from the blank transfersomes spiked with their CRS demonstrated respectively the precision and accuracy of the method.The test solutions were stable (RSD ≤ 0.90%) in 12 h.The contents of NGR1, GRg1, GRe, GRb1and GRd in the transfersomes were 98.14, 380.80, 41.68, 317.50, 75.61 μg/mL, and their encapsulation efficiencies were 75.48%, 69.68%, 69.51%, 92.35%, 95.97%, respectively.UPLC is fast, accurate, precise and applicable to the determination of the contents of NGR1, GRg1, GRe, GRb1and GRd in the transfersomes and the centrifugal ultrafiltration method coupled with UPLC is applicable to the determination of their encapsulation efficiencies.

saponins; transfersomes; UPLC; centrifugal ultrafiltration; encapsulation efficiencies; encapsulation features; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1; ginsenoside Rd

R283.6

A

0253 - 2670(2022)10 - 3006 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.010

2022-02-24

國家自然科學基金資助項目（82174096）；校級科研基金（國家自然科學基金預研專項）資助項目（2019ZG37）

范煜航，碩士研究生，研究方向為經皮吸收脂質囊泡新劑型及其體內過程。Tel: 18768131106 E-mail: fanyuhang1016@163.com

通信作者：鄭杭生，碩士生導師，主要從事經皮吸收新劑型及其體內過程研究。Tel: (0571)61768157 E-mail: hs-zheng@163.com

#共同第一作者：徐 暢，碩士研究生，研究方向為經皮吸收脂質囊泡新劑型及其體內過程。Tel: 17826865411 E-mail: xu_xile@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]