結直腸癌差異表達基因篩選及其與患者預后關系生物信息學分析

郭勇亮（天津市北辰醫院,天津 300400）

2020年全球范圍內的腫瘤流行病學研究顯示，2018年全世界新增結直腸癌（CRC）病例超過180萬例，死亡病例為88.1萬[1]。目前，大多數研究證實，CRC是由結直腸腺瘤逐步發展演化而來，但其進展為癌的分子機制并未完全清晰。隨著分子生物學和高通量技術的進步，更多的證據指向多基因集的時空表達失調在CRC發生中發揮重要機制[2]。本研究采用生物信息分析技術，探討結直腸癌差異表達基因篩選及其與患者預后關系。

1 材料和方法

1.1 試驗設計 本研究的設計思路為首先在結直腸癌與正常腸上皮差異表達的多個數據集中篩選出差異表達基因譜系，并對共差異表達基因進行鑒定；然后對共差異表達基因進行拓撲網絡分析、GO+KEGG分析富集和hub基因篩選；對篩選出的hub基因分析其與CRC生存的關系，具體設計和實施見圖1。

圖1 研究分析的流程圖

1.2 數據及材料 基因綜合表達數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）、京都基因與基因組百科全書（KEGG）、蛋白互相作用拓撲網絡數據庫（STRING）、腫瘤生存分析數據庫（Kaplan-Meier），作為本次研究的主要數據來源。

1.3 方法 GEO數據庫中檢索CRC基因表達數據集，檢索詞為“colorectal cancer/colon cancer/rectal cancer”，種屬為“homo”。進一步對檢索到的結果進行篩選，選取了GSE32323[3]、GSE21510[4]和GSE9348[5]數據為研究對象三個數據集進行分析。根據數據集中CRC患者結直腸癌組織與正常腸上皮組織中基因表達譜情況進行篩選，篩選條件為CRC組和正常組中上調或下調超過2個拷貝的基因，且P＜0.05；分別對上述數據集中篩查出的差異表達基因進行分析，鑒定出共差異基因，并繪制Venn圖。在STRING數據庫中對篩選出的共差異表達基因進行蛋白相互作用拓撲網絡構建，構建條件為：數據來源Textmining，co-expression，gene function 和co-occurrence；相互作用關系系數≥0.4；相互作用蛋白不高于20個。在KEGG數據庫中對篩選出的差異表達基因相關信號通路進行富集分析。采用Cytoscapev3.7.2軟件對拓撲網絡中的hub基因篩選關鍵hub基因，篩選依據為node-score。

1.4 統計學處理 本研究涉及的數據采用R軟件及對應的統計包進行分析，計量資料應用±s表示，應用t檢驗；計數采用率表示，應用卡方檢驗，P＜0.05表示有統計意義。

2 結果

2.1 CRC差異表達基因篩選 選取了GSE32323、GSE21510和GSE9348數據為研究對象，3個數據集基本特征見表1。3個數據集中共差異表達的基因為23個（見圖2）。

表1 納入分析的4個數據基本特征

圖2 CRC差異表達基因篩選火山圖和Venn圖（A：GSE32323數據集；B：GSE9348數據集；C：GSE21510數據集；D：3個數據集Venn圖）

2.2 差異表達基因GO及KEGG分析 23個差異表達基因GO分析主要富集于DNA聚合酶活性的正向調節、核苷酸切除修復；DNA缺口填充、染色體復制叉；DNA酶活性和ATP結合等（見表2）；KEGG信號通路主要富集于消化系統腫瘤、JAK-STAT信號通路和趨化因子信號通路等（見表3）。

表2 差異表達基因GO富集

表3 KEGG信號通路富集

2.3 差異表達基因聚類熱圖分析 根據CRC與正常肝組織23個差異基因表達水平繪制聚類熱圖，CRC腫瘤組織與正常組織間聚類明顯，見圖3。

圖3 CRC差異表達的23個基因聚類熱圖

2.4 PPI拓撲網絡及hub基因 23個CRC與正常腸上皮組織差異表達基因繪制PPI拓撲網絡，網絡中有43個蛋白節點，75個作用關系，平均作用度為3.49，區域聚類指數為0.417。Cytoscapev3.7.2軟件對拓撲網絡中的hub基因進行篩選，RFC5為23個差異基因中的關鍵hub基因，見圖4。

圖4 37個差異表達基因PPI拓撲網絡及hub基因

2.5 hub基因與CRC預后分析 RFC5（HR=0.60，P=0.019）和RFC1（HR=0.58，P=0.017）高表達組OS顯著高于低表達組，其有統計學差異（P＜0.05）；而RFC5和RFC1高表達組PFS與低表達組比較，無統計學差異（P＞0.05），見圖5。

圖5 三個hub基因差別與CRC預后關系的生存曲線

3 討論

2015年中國新增結直腸癌患者約37.6萬例，結直腸癌死亡患者約19.1萬例，占惡性腫瘤發病率和死亡率的五分之一[6]。近年來雖然CRC的診斷方面取得了重大進展，但在CRC確診時大多數患者已發展為中晚期，預后較差。目前，大多數研究證實，結直腸癌是由結直腸腺瘤逐步發展演化而來，但其進展為癌的分子機制并未完全清晰。隨著分子生物學和高通量技術的進步，更多的證據指向多基因集的時空表達失調在CRC發生中發揮重要機制。高通量測序（如微陣列和RNA測序）的轉錄組分析被認為是癌癥研究中很有前途的工具，可以識別候選預后和診斷生物標志物的通路和基因[7]。此外，這些生物標志物可能為改善CRC的預防和治療帶來突破性進展。近年來，對基因表達數據的生物信息學分析探索了CRC潛在的基因生物標志物，但有時生物信息學結果并不完全一致[8-9]。在此背景下，將多個分子生物檢測結果進行匯總分析有望提高結論的可靠性。此外，在CRC中已經從微陣列數據集中識別出大量的DEG。然而，尚未完全了解DEGs在CRC進展相關的分子機制和信號網絡中的作用。

在本研究中，對3個CRC數據集進行了綜合分析，篩選出了共差異表達基因，并對共差異基因進行了功能富集、信號通路及與患者預后相關性研究。結果顯示，GSE32323、GSE21510和GSE9348數據中共差異表達的基因為23個，RFC5為23個差異基因中的關鍵hub基因；RFC5（HR=0.60，P=0.019）和RFC1（HR=0.58，P=0.017）高表達組OS顯著高于低表達組，其有統計學差異（P＜0.05）；而RFC5和RFC1高表達組PFS與低表達組比較，無統計學差異（P＞0.05）。研究認為，RFC5和RFC1可能與CRC的發生有關，并可作為CRC預后良好的分子標志物。

RFC1和RFC5為RFC家族成員，RFC是一個五亞基的蛋白復合物，是DNA復制所必需的。這個異五聚體的亞基被命名為RFC1、RFC2、RFC3、RFC4和RFC5[10]。RFC與DNA的3'端結合同時利用ATP打開PCNA的環并包圍DNA，為后續DNA復制提供條件。據報道，RFC在多種惡性腫瘤中具有生物學活性，可能在腫瘤的增殖、進展、侵襲和轉移中發揮重要作用[10]。根據腫瘤的細胞和組織學特征，它可以作為癌基因或抑癌基因[11-14]。筆者發現，RFC1和RFC5高表達的CRC患者，OS存在明顯優勢，但DFS無差異。結果提示，RFC1和RFC5有可能成為CRC潛在的預后生物學標志物，同時也為CRC的靶向治療提供的新的潛在靶點。