基于數據挖掘的腸易激綜合征動物模型應用特點分析*

何宗卿,經雙雙,智沐君,王慶波

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000)

腸易激綜合征(irritable bowel syndrome，IBS)是以內臟痛覺過敏為主要表現,伴隨排便習慣改變及糞便性狀異常等癥狀的一種功能性胃腸病，常伴有情志疾病。流行病學資料顯示，IBS在世界范圍的發病率為1.1%～29.2%，在我國的發病率為0.82%～11.5%[1]。IBS屬中醫學“腹痛”“泄瀉”范疇。中醫學認為：IBS的病因與七情內傷密不可分；其關鍵病機是憂思憤怒，木失條達，木旺侮土，中焦升降失調，生濕傷脾。運用疏肝健脾法治療IBS有顯著的功效。IBS的主要證型有肝郁脾虛、胃腸濕熱、脾腎陽虛等[2]。近年來，實驗研究多從癥狀、病因、病理機制著手制備IBS模型，而少有從病證結合的角度(既根據西醫理論又結合中醫理論)去制備，以致中醫藥診治IBS研究進展受限。因此，制備客觀的、穩定的、可重復的中醫證型動物模型有助于開展中醫藥治療IBS作用機制的研究。本研究通過檢索文獻，對IBS模型實驗研究文獻中動物種類、造模方法、成模指標進行了統計，對高頻動物模型進行了分析，以期對后續制備病證結合型動物模型提供新思路、新方法。

1 資料與方法

1.1 數據來源

以“腸易激綜合征”和“動物模型”為關鍵詞在中國知網數據庫高級檢索界面進行搜索；以“irritable bowel syndrome”or“colon,irritable”or“colitis,mucous”and“models,animal”or“laboratory animal model”or“animal model”or“experimental animal model”為關鍵詞，在PubMed數據庫高級檢索界面進行搜索。時間范圍是2015年1月—2020年12月，共檢索到期刊論文222篇。

1.2 文獻篩選標準

①納入標準：研究IBS的全部造模成功的動物實驗。②排除標準：會議、碩博論文，綜述類文獻，以及不含具體造模方法的實驗文獻。最終從222篇文獻中得到有效文獻105篇。

1.3 數據處理

詳細閱讀文獻，對文獻中涉及的實驗動物品種、造模方法、觀察指標等逐一輸入Excel 2019建立數據庫，并對數據庫進行分析，制作表格。

2 結 果

2.1 動物種類、性別、年齡階段統計表

根據數據庫統計，計算動物種類占比，結果見表1。造模常用動物種類為鼠類，其中SD大鼠占61.19%，C57BL/6小鼠占17.91%，Wistar大鼠占13.43%；也有少數用兔類[3]和豬類[4]。動物性別主要為雄性，占67.91%，見表2。動物年齡階段主要是成年，占65.67%，見表3。

表1 IBS模型動物種類統計表

表2 IBS模型動物性別統計表

表3 IBS模型動物年齡階段統計表

2.2 IBS造模因素表

單因素造模是只采用唯一一種干預方式進行造模，造模方法為物理、化學刺激、早期生活事件刺激、心理應激、病原體感染等；多因素造模方法是各種因素的組合。近5年的造模方法中，單因素造模占70.90%、多因素造模占29.10%，見表4。各類造模方法中，化學因素刺激占32.84%、單因素物理應激刺激占20.90%、早期生活事件刺激占9.70%、慢性不可預見性刺激占8.21%，見表5。單因素造模方法主要有避水應激占8.96%、母嬰分離占8.96%、乙酸占8.96%、三硝基苯磺酸占7.46%；多因素造模方法中，慢性不可預見性刺激占8.21%、物理應激刺激聯合早期生活事件占7.46%、物理應激聯合化學因素刺激占5.22%。見表6。

表4 IBS造模因素表

表5 IBS具體造模因素表

表6 IBS具體造模方法及造模時間表

2.3 判斷模型成功的指標

文獻顯示，判斷模型成功的主要觀測指標是內臟高敏感性(84次)、腸組織病理形態(37次)、胃腸動力(20次)。見表7。

表7 IBS模型觀測指標表

3 分 析

3.1 常用實驗動物分析

根據近5年的文獻，IBS模型動物種類以鼠類為主，少部分選用兔子[3]、豬[4]等動物；所用動物性別大部分為雄性；實驗動物多為成年。

3.1.1 鼠 類

鼠類飼養價格和使用成本均較低，其繁殖周期短，可操作性強，因此常被用來作為實驗對象。SD大鼠適用范圍廣泛，母嬰分離法常選擇SD新生大鼠做模型動物，以直結腸機械刺激制造慢性內臟高敏模型通常使用SD幼鼠，其他造模方法亦有選用。研究IBS腸道神經系統時，可選用Wistar大鼠做模型動物。李珊等[9]研究IBS模型大鼠結腸肌間神經叢時，發現Wistar大鼠肌間神經叢中鈣視網膜蛋白陽性神經元分布與人類相似。進行基因敲除類研究時，選用的模型動物均為C57BL/6小鼠。

3.1.2 兔 類

兔的腸道免疫力低下，對環境敏感，易誘發IBS。有研究[3]報道，使用濕熱環境聯合番瀉葉灌胃和電擊法刺激誘導黑眼白兔(WHBE)和日本白兔(JW)IBS，發現WHBE兔較JW兔IBS的微小核糖核酸(miRNAs)表達更顯著，故WHBE兔更適合做IBS模型。然而兔的免疫力低下,容易感染病毒和細菌，常會影響造模成功率。

3.1.3 豬 類

與嚙齒動物對比，豬擁有更發達的中樞神經系統，有與人類更相似的神經解剖結構和認知能力。研究[3]發現，雌性豬對神經誘發刺激表現出更高的敏感性。但是豬的體型較大，飼養成本太高，造模周期過長，可操作性弱，故較少被用作動物模型。

3.2 常用造模方法分析

3.2.1 早期生活事件

采用母嬰分離法。該法是從病因方面造模，可以充分模仿IBS患者的主要病理變化。該模型的特征有：內臟高敏感性、腸道高通透性、腸道微生物區系變化、免疫系統的激活、膽汁酸吸收不良。相關文獻[50]報道，早期生活事件對腸道內環境穩定有長期的影響，但并不會造成小鼠結腸炎或胃腸道感染,符合人類IBS腸道無器質性損傷的病理特征；同時，該模型能永久改變腦-腸軸，造成小鼠抑郁[48]，符合IBS患者心理狀態,適合IBS腦-腸軸的研究。

3.2.2 物理應激刺激

①避水應激(WAS)。該法主要適用于研究IBS腸動力、腸道屏障、結腸組織免疫活性的病理變化，以及IBS與腦-腸軸的關系。先前的研究[51]用WAS誘導腹瀉型IBS(IBS-D)模型，結果發現，避水應激增加了動物結腸腸間神經元分子興奮度，引起結腸動力亢進，可用于神經-胃腸病的綜合研究。文獻[52]報道，經歷過WAS的小鼠表現出內臟超敏感性和低等級的免疫激活是因為促炎細胞因子的表達增加使腸道屏障受損(表現為腸道通透性增加)，但與對照組小鼠對比，腸道組織學評分方面差異無統計學意義。此外，避水應激針對小鼠怕水的特性將其置于水中從而造成小鼠的焦慮狀態[53]。故此模型不僅能模仿IBS生理變異，還能模仿心理變化，也適合做IBS與腦-腸軸相關的研究。

②直結腸機械刺激(CRD)。該法的特點是能穩定制造內臟高敏模型。CRD是對動物的腸腔進行壓力擴張刺激。該方法能穩定地造出慢性內臟超敏癥狀[36]。大多造模對象為乳鼠或者小鼠。研究[54]顯示，對8～21 d新生大鼠進行直結腸機械刺激，待其成年進行AWR評分檢測，發現成年大鼠的AWR評分仍顯著提高，無組織學損傷。但是該方法的制備時間過長，成模需要6周時間。

③束縛應激。束縛應激屬于急性應激刺激。常與母嬰分離、慢性不可預見性應激聯合使用，突出腹痛、腹瀉癥狀。該方法的優點是造模時間短、成本低、方法簡單、無組織學損傷，但有明顯的缺點如應激持續時間太短，通常只持續數小時。有學者[55]將大鼠的前肩、上肢和軀干用紙帶包裹加以限制(而非阻止身體的運動)，然后將大鼠置于籠中2 h,對其進行組織學檢查、內臟高敏感性測試,結果發現大鼠的腸道無明顯炎癥，腹部撤退反射明顯增加。

3.2.3 心理應激

電擊法、睡眠剝奪法是通過給小鼠造成心理壓力，從病因方面誘導IBS癥狀。心理社會壓力是公認的IBS危險因素，據相關文獻[56]報道，80%的IBS患者有焦慮或抑郁心態。電擊法能為腸道微生物對腦-腸軸的影響提供證據。研究發現：電擊后，小鼠的內臟高敏感性、腸道微生物組成發生改變[11]；剝奪動物睡眠后，小鼠內臟痛覺過敏、胃腸動力加快，使用腎上腺激素受體阻滯劑后癥狀得到緩解，提示睡眠剝奪改變了腦-腸軸，使激素分泌水平受到影響從而誘導IBS相關癥狀出現[12]。

3.2.4 化學因素刺激

①乙酸。乙酸刺激造模方法主要用于研究結腸黏膜屏障損傷與內臟高敏感性的關系。目前文獻報道，使用乙酸造模時，劑量差別大。采用0.5%乙酸造出的內臟超敏模型被認為持續時間長、適合研究慢性內臟超敏反應。有學者[57]在大鼠出生第8～12天，每日用0.5%乙酸進行灌胃。6周后，對照組與模型組腸黏膜病理變化無明顯差異，仍存在內臟高敏感狀態。另有研究[58]顯示，4%的乙酸可顯著抑制腸道緊密蛋白的表達，從而提高腸道通透性，破壞腸道屏障的完整性。

②三硝基苯磺酸(TNBS)。TNBS造模方法被廣泛運用于模仿感染型腸易激綜合征(PI-IBS)，可用于研究IBS內臟高敏感性與結腸黏膜病變之間的關系。該方法能導致腸道低度炎癥、持續內臟高敏感性，且建模周期較乙酸短，一般炎癥持續時間為4周。有學者[59]用TNBS刺激小鼠結腸，發現結腸黏膜中N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)含量升高，且與內臟高敏感性程度正相關。

③帶狀皰疹病毒。帶狀皰疹病毒感染是一種新型造模方法，有利于對IBS相關胃腸道肌肉功能及神經功能的研究。病毒感染繼發的復雜神經系統(腸道肌肉叢神經)障礙引起的腸道運動失調。相關人員[24]使用鼻飼、灌胃小鼠，待小鼠穩定一段時間后檢測其相關指標。該病毒能誘導胃腸動力異常、腸道平滑肌收縮程度減小，腸神經系統、炎癥；且與對照組相比，小鼠一般情況如體質量、攝食量等無明顯差異。該模型能模仿IBS復雜的腸道變化。

④促腎上腺激素釋放激素(CRH)。中樞和外周注射CRH造模有助于在病理水平上研究心理壓力及內分泌系統與IBS發病關系。心理壓力引起的內臟功能改變主要是通過激活CRH信號通路介導的[60]。有學者[42]用母嬰分離法慢性應激結合CRH局部注射急性應激，成功造出IBS-D模型。該模型表現出結腸運動亢進，糞便濕重顯著增加，并通過曠場試驗和高架迷宮試驗測試出大鼠焦慮狀態。

3.2.5 生物感染刺激

旋毛蟲感染模型可用于IBS機制研究或評估藥物療效，因為該造模方法會使動物長期存在內臟感覺改變、屏障功能紊亂和低度炎癥。先將旋毛蟲幼蟲溶解在磷酸鹽緩沖溶液，再將其灌入小鼠胃中。8周后，在顯微鏡下觀察PI-IBS模型的結腸組織，未見明顯的炎癥反應，AWR評分顯著增加，提示內臟高敏感性仍然存在[61]。另一篇文獻[62]報道了旋毛蟲感染引起的內臟感覺和腸道運動的改變可以在短暫的腸道感染后持續至少10周。

3.2.6 復合造模方法

①慢性不可預見性造模。使用單一造模方法可能會使動物產生耐受而使干預無效。慢性不可預見造模方法是近年來應用較多的復合因素造模方法，能全面模擬IBS臨床癥狀，有效避免耐受，縮短造模周期，適用于IBS各方面的研究。實驗人員將多種性質不同的應激事件共用以誘導，可造成模型動物持久性的內臟高敏感性癥狀、抑郁焦慮狀態及胃腸道功能紊亂。樊江波等[63]將多項物理應激刺激相結合，即禁食禁水、日夜顛倒、冷刺激、熱刺激、夾尾刺激、束縛制動、高頻制動等循環操作40 d，可導致大鼠胃腸運動亢進、內臟高敏感性相關癥狀和精神失調等。

②多法聯合造模。多法聯合造模中占比最高的是物理應激刺激聯合早期生活事件、物理應激刺激聯合化學因素刺激。早期生活事件能造成持續穩定的內臟高敏感性癥狀及其心理壓力，聯合其他刺激方法可使IBS模型特點有所側重。早期生活事件聯合物理應激刺激能突出內臟高敏感性癥狀表現，適用于內臟高敏感機制的研究;而早期生活事件聯合化學刺激法則能突出結腸屏障病理改變的作用。

3.3 評價模型成功的方法及內容

3.3.1 內臟高敏感性

本研究顯示，以內臟高敏感性作為成模指標的頻數最高。其方法有：①AWR評分≥2分即可認為造模成功。②以腹直肌肌電放電(abdominal electromyogram,AEMG)圖為指標，反映直結腸對機械刺激的反應。③也有少數用醋酸刺激小鼠，觀察小鼠扭體劇烈程度，以判斷內臟高敏感性。

3.3.2 糞便

一般觀測糞便顆粒數量，計算干濕重百分比；或者用Bristol評分評價糞便形態用以判斷腸動力是否異常。

3.3.3 行為心理狀態

①曠場試驗：模型動物在曠場箱中穿格數、站立數顯著減少。②蔗糖試驗：模型動物糖水偏愛率(消耗糖水溶液的量與總液體的量的比值)較正常組顯著降低。③強迫游泳時，小鼠潛伏于水下，停止掙扎時間明顯增加。這些試驗均可用以判斷模型動物的抑郁狀態。

3.3.4 腸道動力

常用碳粉試驗，記錄碳粉通過腸道的時間[64]，用以判斷腸動力是否異常。

3.3.5 一般情況

常作為成模的輔助指標，通常觀測動物的體質量、疲勞狀態、食欲等。

3.3.6 腸道組織病理學觀察

用以觀察IBS腸道組織炎癥改變。①通過MPO活性測定。IBS腸道組織MPO應與正常人無顯著差別。②先采用HE染色法，然后以顯微鏡觀察腸道組織形態來判斷炎癥程度，因為IBS并無腸道器質性病理改變，故腸組織無明顯損傷現象或者僅有輕度炎癥，與對照組相比無明顯差異即可認為造模成功[16]。HE染色法同樣可以檢測腸道通透性。③使用蛋白質印跡法檢測緊密蛋白的表達情況。IBS腸道組織緊密蛋白表達較健康人顯著降低。

3.3.7 5-羥色胺

腦-腸軸的病理改變與IBS有密不可分的聯系。這類檢測有利于在病理水平上解釋IBS抑郁狀態的產生及內臟痛覺敏感。常用酶聯免疫吸附試驗檢測腸道組織或中樞神經組織中5-羥色胺的含量來反映IBS腦-腸軸的病理改變。

4 討 論

本研究結果顯示：在IBS動物模型中，SD大鼠為最常用實驗動物，以雄性成年大鼠居多；單因素造模方法的運用遠多于多因素造模方法。采用較多的單因素造模方法是：避水應激法、母嬰分離法、乙酸刺激法。采用較多的多因素造模方法是：慢性不可預見性刺激法、物理應激刺激聯合早期生活事件法、物理應激刺激聯合化學因素刺激法。

肝郁脾虛型IBS動物模型應同時具備情志改變、腹痛及排便功能異常的癥狀。若使用單獨注射乙酸、三硝基苯磺酸和病原體感染造模方法可成功復制脾虛證型，引起腹瀉、體質量下降，但均缺少情志方面的改變的報道。使用避水應激法、母嬰分離法均可造出復雜癥狀模型，可模擬產生痛覺過敏、情志抑郁、腸道運動功能亢進的癥狀，較為契合肝郁脾虛的證型，但是模型特點因方法不同而有所側重，整體效果不如復合因素造模明顯[64]。故目前病證結合模型逐漸使用復合因素造模方法。

復合因素造模方法強調整體影響因素，從各個方面模仿疾病及證型形成的自然狀態。近5年常用的方法是使用慢性不可預見性應激或兩種方法結合。慢性不可預見性應激是多項應激隨機結合使用，通過束縛夾尾刺激等激惹動物使動物表現出內臟高敏感性和抑郁心態，造成肝郁狀態；又通過禁食禁水、日夜顛倒方式刺激動物，改變胃腸動力，造成脾虛狀態。此是目前制備IBS肝郁脾虛型的主要造模方法。

近5年來，母嬰分離法結合物理應激或化學應激也是肝郁脾虛型模型的熱門造模方法。單用物理、化學應激可造出胃腸動力異常即脾虛型，但難以誘導抑郁心理即肝郁證型，故結合母嬰分離法以彌補該方面空缺。多法聯合造模雖然操作難度較單因素造模方法更大、不可控因素更多，但可從病因病機上完善病證結合。

此外，還有一些新穎的造模方法可用來完善肝郁脾虛型模型。如：通過外周或中樞注射CRF聯合物理應激。此方法是通過注射CRF來影響腦-腸軸造成心理、胃腸功能異常，注射CRF劑量統一，可復制性強，安全性高，造模周期短。此外，心理應激如電擊法、睡眠剝奪法可從病因方面誘導IBS相關癥狀，側重于對肝郁證型的影響，可結合其他方法綜合應用。

成模指標方面，應同時觀測情志方面和胃腸道的異常。AWR評分可判斷內臟高敏感性程度，迷宮試驗、蔗糖攝取量可判斷焦慮抑郁狀態，Bristol評分和碳粉試驗可判斷腸道運動功能的改變等。

動物模型是探索疾病發病機制、研制新的治療方法的重要基礎。因此，建立高度吻合中西醫臨床病證的動物模型是后續研究的目標，以期能夠較好地模擬臨床癥狀。