GbCDPK83基因在干旱脅迫下的功能鑒定

2022-05-19 13:47:52史光珍朱新霞

西北農業學報 2022年4期

史光珍，高鑫，朱新霞

(石河子大學生命科學學院，綠洲城鎮與山盆系統生態兵團重點實驗室，新疆石河子 832003)

棉花是重要的經濟作物也是最重要的纖維作物之一。干旱是制約棉花產業發展的一大問題，它會使棉花葉片出現萎蔫，棉株生長和發育受阻，對棉花的產量、品質影響非常大[1-2]。新疆是中國最大的商品棉生產基地，海島棉纖維品質優良、生育期較長，主要在無霜期較長的南疆種植，而南疆又干旱、少雨，挖掘海島棉的耐旱基因，提高海島棉的耐旱性是目前亟待解決的主要問題。

為了應對干旱脅迫，植物需要進行轉錄調控以盡量減少干旱對植物的危害。鈣依賴性蛋白激酶(calcium dependent protein kinase,CDPKs)是一類重要的鈣信號感受響應蛋白，當植物處于逆境時，C端與EF-hands結構結合，CDPKs的活性被激活，從而引發調控過程改變，使得植物細胞的生理生化發生變化，提高植物對不良環境的耐受性[3]。前期研究報道在擬南芥中，AtCPK10基因可通過參與 ABA 途徑，增強植株耐旱性[4]；過表達AtCPK8可以顯著提高轉基因植株的抗旱能力[5]；在水稻中，過表達OsCDPK7可顯著提高轉基因植株的抗旱能力[6]。這些研究結果說明 CDPKs可能參與了植物對干旱脅迫的響應。

病毒介導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)是一種利用 TRV 病毒來構建特異性載體，進行基因轉化實現基因沉默的技術，VIGS技術在植物抗逆、抗病等相關基因功能鑒定中已被廣泛應用[7]。

綠洲城鎮與山盆系統生態兵團重點實驗室前期發現，GbCDPK83基因在棉花植株受干旱脅迫時上調表達，為研究該基因對棉花抗旱性的影響，本研究采用基因沉默技術，在棉花幼苗中將GbCDPK83基因沉默，對沉默植株及對照植株作干旱脅迫處理，通過觀察測定沉默植株與對照植株表型差異及生理生化指標變化，探究GbCDPK83基因的功能，為提高海島棉抗逆性奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

海島棉H7124(GossypiumbarbadenseL. H7124)，大腸桿菌(Esherichiacoli) DH5α、農桿菌GV3101、pTRV1(輔助載體)、pTRV2均由綠洲城鎮與山盆系統生態兵團重點實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及cDNA的制備采集海島棉幼苗葉片，加液氮充分研磨后，使用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的RNA提取試劑盒和反轉錄cDNA試劑盒，按照說明書進行操作，得到海島棉cDNA。

1.2.2GbCDPK83的克隆從CottonFGD(https://cottonfgd.org/)數據庫中調取GbCDPK83的序列，使用Primer Premier 5.0設計特異性引物(表1)。以反轉錄的海島棉cDNA為模板進行PCR擴增，PCR體系共20 μL：1 μL cDNA模板、1 μL混合引物、10 μL 2×Mix、8 μL ddH2O補足體積。PCR反應程序為：94 ℃預變性 4 min；94 ℃變性30 s，59 ℃復性30 s，72 ℃延伸 2 min，35個循環；72 ℃延伸7 min；16 ℃保存。PCR產物用10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，回收、純化，送上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。

1.2.3GbCDPK83的生物信息學分析基于該基因的氨基酸序列，利用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam)分析蛋白的理化性質；ProtScale(https://web.expasy.org/protscale)分析蛋白的親/疏水性；TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)預測蛋白的跨膜結構域；SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)分析蛋白的信號肽序列；PRABI-GERLAND(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin)預測蛋白的二級結構；SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)預測蛋白的高級結構；SMART MODE(http://smart.embl-heidelberg.de)分析蛋白的結構域；PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html)預測蛋白的亞細胞定位信息。

1.2.4 VIGS載體構建以pMD-19T-GbCDPK83為模板進行PCR擴增，所用引物見表1，表1中的下劃線為酶切位點，得到VIGS片段，對pTRV2空載體用BamH I和XhoI進行雙酶切，得到線性化載體。將回收所得VIGS片段與pTRV2線性載體用T4連接酶連接，轉入DH5α感受態細胞，經PCR及雙酶切鑒定，成功構建載體pTRV-GbCDPK83。

1.2.5 VIGS沉默及相對表達量檢測選取出苗10 d的海島棉H7124，分別向子葉注射含有重組載體pTRV1/pTRV2-GhCLA1的農桿菌菌液和含有GbCDPK83基因沉默載體pTRV1/pTRV2-GbCDPK83的農桿菌菌液，以非轉基因植株和注射了僅含有空載體的農桿菌菌液的棉花植株作為對照，置于25 ℃黑暗培養24 h后于適宜條件下培養。當pTRV-GhCLA1的侵染苗表現出白化后，分別采集沉默植株(pTRV-GbCDPK83)和對照植株第二片真葉液氮保存，提取RNA反轉錄成cDNA，以UBQ7做內參基因，所用引物見表1，利用SYBR Green實時定量PCR染料對GbCDPK83基因進行實時熒光定量PCR，所得數據用 2-ΔΔCt方法計算獲得相對表達量[8]。

表1 所用引物

1.2.6GbCDPK83基因的功能探究將非轉基因棉株(CK)、空載對照棉株(pTRV-00)、試驗組(pTRV-GbCDPK83)分為兩組，對其中一組進行干旱脅迫處理，另一組以正常條件進行培養。培養一段時間后，觀察表型變化，并取葉片進行相對含水量、相對電導率、脯氨酸含量、丙二醛含量的測定。

2 結果與分析

2.1 GbCDPK83基因的克隆

以反轉錄獲取的海島棉cDNA為模板，通過PCR擴增GbCDPK83基因，10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示，克隆得到全長1 611 bp的GbCDPK83基因序列，測序后比對，與數據庫中的CDS序列相一致。

1,2. PCR擴增產物； M. DL2000 DNA Marker

2.2 GbCDPK83蛋白的生物信息學分析

2.2.1 GbCDPK83蛋白理化性質分析 GbCDPK83共編碼536個氨基酸，其中精氨酸和賴氨酸(帶正電荷)共計67個，天冬氨酸和谷氨酸(帶負電荷)共計76個；單個數目最多的賴氨酸殘基(Lys)共41個(7.6%)，數目最少的色氨酸殘基(Trp)僅5個(0.9 %)。分子式C2668H4205N741O810S25，相對分子質量60 423.72 u，理論等電點(pI)為6.09。

2.2.2 GbCDPK83蛋白的親/疏水性分析利用ProtScale分析GbCDPK83蛋白的親疏水性，匯總為圖2的曲線。其中131和132位的Lys和Glu評分最低(-3.144)，即親水性最高，而評分最高(2.744)的是279位的Leu，即疏水性最高。就整體而言，GbCDPK83蛋白表現為親水性。

圖2 GbCDPK83蛋白的親/疏水性分析

2.2.3 GbCDPK83蛋白的跨膜結構域分析與信號肽預測經TMHMM Server v.2.0分析 GbCDPK83蛋白無跨膜結構域，為非跨膜蛋白。SignalP-5.0 Server分析GbCDPK83蛋白的信號肽預測評價為0.003，而無信號肽(其他)的評價為0.997，表明GbCDPK83蛋白并不具備信號肽。

2.2.4 GbCDPK83蛋白的二級結構和三級結構分析使用PRABI-GERLAND預測二級結構，發現GbCDPK83蛋白二級結構組成主要為α螺旋(224個氨基酸殘基，占比41.79%)，其次為無規卷曲(211個氨基酸殘基，占比39.37%)，β轉角(48個氨基酸殘基，占比8.96%)。使用SWISS-MODEL預測三級結構，發現GbCDPK83蛋白三級結構空間構象中包含大量的α螺旋，此外還有β轉角及一些無規卷曲，與二級結構預測相符。

2.2.5 GbCDPK83蛋白的結構域分析結構域預測此蛋白在89～347位具有一個Ser/Thr 蛋白激酶基序，在394～422、430～458、466～494、 501～529四個位置，有4個可結合Ca2+進而激活其活性的EF-hands結構(圖3)，說明GbCDPK83蛋白具有CDPKs特有的結構。

圖3 GbCDPK83蛋白的結構域預測

2.2.6 GbCDPK83蛋白的亞細胞定位預測在線分析工具的預測結果：質膜0.850，內質網膜 0.496，微體(過氧化物酶體)0.306，葉綠體內膜 0.118，說明GbCDPK83蛋白發揮生物學功能的位點有可能在質膜上。

2.3 GbCDPK83的基因沉默

2.3.1GbCDPK83基因的VIGS載體構建瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖4-A，說明擴增出大小為403 bp的GbCDPK83基因沉默片段。使用BamH I和XhoI對構建的VIGS載體進行雙酶切鑒定(圖4-B)，發現VIGS片段與空載體pTRV-00成功連接，表明沉默載體構建成功。

A. GbCDPK83沉默片段擴增產物；1. 陰性對照；2. 沉默片段；M. DL2000 DNA Marker;B. 沉默載體雙酶切結果； 1. 雙酶切結果；2. 質粒對照；M. Marker Ⅲ

2.3.2GbCDPK83基因的沉默及相對表達量測定 VIGS侵染后的結果如圖5所示，注射空載體和注射GbCDPK83沉默載體菌液的棉花葉片顏色正常，未出現白化現象。而注射GhCLA1沉默載體菌液的棉花植株，葉片表現出明顯白化，表明本試驗所使用的沉默載體可用于棉花VIGS沉默研究。

pTRV-GhCLA1. CLA1基因沉默植株；pTRV-00.TRV空載體植株； pTRV- GbCDPK83. GbCDPK83基因沉默植株

相對于注射了空載體pTRV-00的棉株，注射GbCDPK83沉默載體菌液的棉花植株，表達量極顯著降低(圖6)，表明TRV體系成功抑制了GbCDPK83基因的表達。

2.4 GbCDPK83基因的功能探究

2.4.1 干旱脅迫處理后表型變化自然干旱10 d 后，注射pTRV-GhCLA1的植株失水萎蔫，注射空載體和pTRV-GbCDPK83的植株嚴重失水枯萎，注射 pTRV-GbCDPK83的葉片枯萎更嚴重(圖7-A)。離體葉片在20%PEG中，非轉基因植株的葉片萎蔫程度較輕，注射pTRV-GbCDPK83的沉默植株萎蔫嚴重(圖7-B)。

*P<0.05,**P<0.01

pTRV-GhCLA1. CLA1基因沉默植株；WT. 非轉基因植株； pTRV-00.TRV空載體植株；pTRV- GbCDPK83. GbCDPK83基因沉默植株;A.干旱脅迫10 d后的棉花；B.干旱脅迫后的離體葉片

2.4.2 生理指標測定結果在正常狀態下，空載體植株相對含水量最高，GbCDPK83基因沉默植株的相對含水量和非轉基因的植株相差不大。干旱脅迫后，相對含水量均降低，其中GbCDPK83基因沉默植株的相對含水量極顯著降低(圖8-A)。

在正常狀態下，空載體植株相對電導率最高，GbCDPK83基因沉默植株的相對電導率最低。干旱脅迫后，相對電導率均升高，其中GbCDPK83基因沉默植株的相對電導率極顯著上升(圖8-B)。

在正常狀態下，空載體植株脯氨酸含量最高，GbCDPK83基因沉默植株的脯氨酸含量介于空載體植株和非轉基因植株之間。干旱脅迫后，脯氨酸含量均增加，但非轉基因植株的脯氨酸含量增加的最多，空載體植株次之，GbCDPK83基因沉默植株增加的最少(圖8-C)。

在正常狀態下，空載體植株丙二醛含量最低，GbCDPK83基因沉默植株的丙二醛含量介于非轉基因植株和空載體植株之間。干旱脅迫后，MDA 含量均有升高，GbCDPK83基因沉默植株的MDA 含量極顯著上升，空載體植株次之，非轉基因植株上升的不明顯(圖8-D)。

圖8 正常與干旱脅迫狀態下生理指標

3 討論

GbCDPK83蛋白具有CDPK家族典型的結構，二級結構和三級結構預測該蛋白主要由α-螺旋組成，前人研究報道CDPKs中EF-hand功能域是保守的，該功能域中的保守氨基酸殘基多數位于α-螺旋中，GbCDPK83蛋白具有相同的結構[9]。

VIGS技術能夠在短期內穩定的將目標基因沉默，進而通過表型、生理生化指標對目標基因進行功能分析[10]。為了進一步研究GbCDPK83的功能，本研究利用VIGS技術構建沉默表達載體，經分析沉默GbCDPK83基因前后基因表達量，發現TRV體系成功抑制了GbCDPK83基因的表達。

干旱脅迫下植物的生長發育變緩，其原因就是植物體內水分缺失，造成了滲調物質增加、膜脂過氧化損傷[11]。丙二醛和電導率是反映植物細胞膜損傷程度的重要指標，干旱脅迫會增加丙二醛含量和電導率[12]。脯氨酸對維持植物細胞滲透調節的平衡起著重要作用，脯氨酸含量越高，抗旱能力越強[13]，干旱脅迫后，GbCDPK83基因沉默植株的相對含水量顯著降低，相對電導率和丙二醛含量顯著上升，脯氨酸含量升高但低于空載體及非轉基因植株，可能是GbCDPK83基因沉默植株中，GbCDPK83基因表達受到了抑制，GbCDPK83蛋白在細胞內的水平降低，響應干旱脅迫時，傳遞信號的能力受到影響，使得細胞無法及時適應干旱脅迫帶來的不利影響，因此受到了比GbCDPK83基因正常表達植株更嚴重的細胞膜損傷，滲透調節平衡能力也受到影響。