寧夏部分地區新生犢牛腹瀉的病原調查及主要病原的遺傳進化分析

郭仕輝，趙清梅，陳紹淑，張浩東，田新岳，張津慎，許立華，馬 云，余永濤

(1.寧夏大學 農學院，銀川 750021；2.北方民族大學 生物科學與工程學院，銀川 750021；3.國家民委發酵釀造工程生物技術重點實驗室，銀川 750021)

犢牛腹瀉是犢牛發生的以消化不良、腹瀉為主要臨床特征的消化道疾病綜合征。犢牛腹瀉多發生于斷奶前的新生哺乳犢牛，故通常將哺乳期犢牛腹瀉稱為新生犢牛腹瀉(Neonatal calf diarrhea，NCD)[1]。NCD是造成斷奶前犢牛死亡的最主要原因之一。據報道，美國NCD的死亡率為57%，韓國為53.4%[2]，給奶牛和肉牛養殖業帶來了巨大的經濟損失。此外，NCD還會造成后備母牛生長緩慢、生產性能和免疫力低下，飼養和治療成本增加，嚴重制約牛場的良種選育和牛群擴繁[3]。研究表明，中國犢牛腹瀉的發病率為 9.6%～60.0%，死亡率大約為1%，但大多研究未對NCD和斷奶后犢牛腹瀉進行嚴格區分，NCD的發病情況和死亡率未明確報道[4]。哺乳期犢牛和斷奶后犢牛在生理機能和消化道解剖結構、飼養管理方式等方面有很大不同，這也決定了NCD和斷奶后犢牛腹瀉的發病特點、病原流行特點會有所差別，對NCD進行深入系統地研究有助于犢牛腹瀉的早期防控[5]。

腸道病原感染是造成犢牛腹瀉的主要原因，流行病學研究表明牛輪狀病毒(Bovine Rotavirus，BRV)、牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCoV)、K99型大腸桿菌和隱孢子蟲(Cryptosporidium)是引起犢牛腹瀉的最常見病原[6]。此外，沙門氏菌(Salmonella)、產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringen)、牛病毒性腹瀉病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)、十二指腸賈第鞭毛蟲(Giardiaduodenalis)等感染也可導致犢牛腹瀉[7]。近年研究發現，在美國、韓國、埃及等數十個國家腹瀉犢牛的糞便中檢出或分離到牛諾如病毒(Bovine Norovirus，BNoV)和紐布病毒(Nebovirus, NeV)，這兩種病毒可造成腸道黏膜上皮細胞的損傷，可能也是造成犢牛腹瀉的重要病原[8-10]。自2018年以來，中國多地也檢測到BNoV，但BNoV在寧夏地區的流行情況尚不清楚[11-13]。目前寧夏地區關于犢牛腹瀉相關病原的流行病學研究較少，王文佳等[14]、高海慧等[15]對寧夏地區腹瀉犢牛主要病原進行了流行病學調查，但沒有明確斷奶前犢牛的病原檢出情況，且未對BCoV、BNoV等其他相關病原進行調查。

為了解寧夏部分地區NCD相關病原的流行情況及主要病原的遺傳進化規律，本研究擬對寧夏地區主要奶牛養殖區域的部分中大型規模化牛場中2月齡內的斷奶前犢牛進行腹瀉相關病原檢測及主要病原的遺傳進化關系研究，以期為寧夏地區犢牛腹瀉的早期防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗材料 2019年7月至2019年9月對寧夏銀川市、吳忠市、石嘴山市主要奶牛養殖園區的9個中大型規模化奶牛場2月齡內的斷奶前犢牛糞便樣本進行隨機采集，共采集腹瀉犢牛糞便106份和健康犢牛糞便89份。詳見表1。

表1 采樣情況

根據威斯康星大學麥迪遜分校的糞便評分標準對犢牛是否發生腹瀉進行評判[16]。糞便成型、質地良好為0分，為健康犢牛。半成型、糞便稀軟為1分，為健康犢牛。糞便稀軟、不成型為2分，為腹瀉犢牛。糞便完全成液體狀為3分，為腹瀉犢牛。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)、反轉錄試劑盒(PrimescriptTM1st Strand NCDNA Synthesis Kit)、PremixTaqTM、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0)、DL 1000 DNA Marker均購自寶日醫生物技術(北京)有限公司；糞便DNA提取試劑盒(Stool DNA Kit)購自OMEGA公司。

1.1.3 主要儀器 凝膠成像系統(Bio-Rad，ChemiDoc XRS+)、PCR儀(Bio-Rad，S1000 Thermal Cycler)、臺式高速冷凍離心機(Eppendorf，5430)。

1.2 方 法

1.2.1 樣本采集 首先對待采集犢牛進行日齡等背景信息統計，然后進行糞便樣本采集。采用Gomez等[16]報道的腸道侵入法對犢牛直腸糞便進行采集。用酒精棉球對肛門周邊區域進行清潔和消毒，佩戴一次性無菌橡膠手套并將食指伸入直腸內輕輕刺激腸壁直至犢牛排出糞便于掌心。將糞便轉移至一次性無菌糞便收集杯并置于冰盒中，帶回實驗室于-80 ℃保存，用于病原檢測。

1.2.2 PCR檢測 首先按照糞便DNA提取試劑盒說明書提取DNA，然后分別采用K99型大腸桿菌和隱孢子蟲的特異性引物進行PCR擴增[17-18]。K99型大腸桿菌 PCR擴增體系為Premix 11.25 μL，DNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，dd H2O 11.75 μL。反應條件為94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。隱孢子蟲檢測采用巢氏PCR，第一輪擴增體系和反應體系同K99型大腸桿菌，退火溫度為55 ℃；第二輪擴增模板為第一輪PCR產物，擴增體系和反應體系同K99型大腸桿菌，退火溫度為58 ℃。

另將糞便樣本與PBS溶液按1∶5的體積比充分渦旋混勻，-80 ℃冰箱反復凍融3次，3 000 r/min離心10 min，棄沉淀，上清12 000 r/min離心30 min，離心后取上清用于RNA提取。根據RNA提取試劑盒(RNAiso Plus)操作程序對處理樣本進行RNA提取。根據PrimescriptTM反轉錄試劑盒操作程序將提取的總RNA反轉錄為cDNA。分別參照BRVVP6基因、BCoVN蛋白[19]基因、BNoVRdRp基因[12]、NeVRdRp基因[11]和BVDV5′UTR基因[20]設計并合成引物。以cDNA為模板進行PCR擴增。最后取PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像系統進行檢測和分析。引物信息詳見表2。

表2 引物信息

1.2.3 主要病原的遺傳進化分析 根據檢測結果，對BRV、BCoV、BNoV和隱孢子蟲等主要病原進行遺傳進化分析。將PCR產物經瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收，送至上海生工生物有限公司雙向測序。所得序列采用SeqMan(DNAstar 7.0)軟件進行序列拼接，在NCBI數據庫(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中進行BLAST比對。應用DNAstar軟件中的MegAlign程序對BLAST比對中序列一致性較高的同源序列進行Align分析，根據Align結果，應用Mega 7.0軟件采用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.2.4 統計分析 應用EXCEL 2016軟件對病原檢測結果進行統計分析并繪圖。

2 結果與分析

2.1 腹瀉情況統計

對隨機采集的106份腹瀉犢牛日齡信息進行統計，結果如表3所示。11～20日齡的腹瀉犢牛占比最高(33.0%)，其次是1～10日齡(31.1%)和21～30日齡(17.9%)，其他日齡的腹瀉犢牛占比較低，均小于10%。

表3 腹瀉犢牛日齡信息分布情況

2.2 病原檢測

2.2.1 主要病原檢出結果 對PCR檢測結果進行統計，結果如表4所示。腹瀉犢牛BRV、BCoV、BNoV、NeV、K99型大腸桿菌和隱孢子蟲檢出率分別為19.8%、9.43%、12.26%、0.94%、2.83%和6.60%，BVDV檢出率為0。健康犢牛BCoV、BNoV、NeV、K99型大腸桿菌和隱孢子蟲檢出率分別為5.62%、5.62%、1.12%、1.12%和3.37%，BRV和BVDV檢出率為0。

表4 主要病原檢出結果

2.2.2 主要病原感染情況 各牛場腹瀉犢牛主要病原檢出結果如圖1所示。檢出2種以上病原的牛場有7個，檢出3種以上病原的牛場有5個，檢出4種以上病原的牛場有2個。BRV、BCoV、BNoV、NeV、BVDV、K99型大腸桿菌和隱孢子蟲的場群流行率分別為77.8%(7/9)、44.5%(4/9)、55.6%(5/9)、11.1%(1/9)、0(0/9)、11.1%(1/9)和33.3%(3/9)。其中BRV牛場檢出率最高，其次是BNoV、BCoV和隱孢子蟲，最后是NeV和K99型大腸桿菌，BVDV未檢出。BCoV檢出主要集中在牛場F4和F7，BNoV檢出主要集中在牛場F5和F8，隱孢子蟲檢出主要集中在牛場F7、F5和F1，NeV僅在F3牛場檢出，K99型大腸桿菌僅在F7牛場檢出。

圖1 9個牛場腹瀉犢牛NCD相關病原檢出情況

對腹瀉犢牛中BRV、BCoV、BNoV和隱孢子蟲等4種檢出率較高的病原進行混合感染情況統計，結果如表5所示，單一病原感染的犢牛占 30.2%，2種病原混合感染的犢牛占7.55%、3 種病原混合感染的犢牛占0.94%，未出現4種病原混合感染的情況。腹瀉犢牛主要為單一病原感染，其中BRV(15.1%)、BNoV(10.4%)和BCoV(4.72%)單一感染率較高，隱孢子蟲在混合感染患牛中檢出率較高。

表5 腹瀉犢牛混合感染情況

2.2.3 不同日齡犢牛的病原檢出結果 將腹瀉犢牛中檢出率較高的BRV、BCoV、BNoV和隱孢子蟲共4種主要病原檢出結果按照日齡進行分類，結果如表6所示。感染BRV、BCoV和隱孢子蟲的腹瀉犢牛主要在30日齡以內，感染BNoV的腹瀉犢牛主要在20日齡以內。

表6 不同日齡腹瀉犢牛中主要病原檢出情況

2.3 NCD主要病原的遺傳進化分析

2.3.1 BRV 對21個BRV陽性樣品的VP6基因PCR產物進行測序。測序結果表明，獲得的21個序列中有10個核苷酸序列不一致，分別為D2、D6、D8、F3、F8、K12、O2、O6、P2和Y7。VP6基因BLAST分析結果表明，所有序列都與GeneBank中已公布的輪狀病毒A群VP6基因同源性最高，核苷酸序列一致性為88.8%～99.3%。遺傳進化分析結果如圖2所示，獲得的10個BRVVP6基因與GeneBank中已公布的BRV A群遺傳進化距離最近。其中D2、D6、D8、F3、F8、K12、O2、O6和P2與中國株(Bo/HB-BD/CH)聚在同一個分支上，Y7株與美國株(Hu/2011825363/USA)單獨聚為一支。

圖2 基于BRV VP6基因序列構建的系統發育樹

2.3.2 BCoV 對15個BCoV陽性樣品的N蛋白基因PCR產物進行測序，結果表明，獲得的15個序列中有9個核苷酸序列不一致，分別為C1、D5、D7、E1、E2、I5、O3、O9和O10。BLAST分析結果表明，所有序列都與GeneBank中已公布的牛冠狀病毒N蛋白基因同源性最高，核苷酸序列一致性為98.9%～99.9%。遺傳進化分析結果如圖3所示，獲得的9個BCoV N蛋白基因全部與GeneBank中已公布的BCoV N蛋白基因遺傳進化距離較近。9個序列與已報道的中國株(Bo/SC1/CH、Bo/LN1/CH)和美國株(Bo/4-17-08/USA)聚在一個大的分支，但C1、D5、D7、E1、O3、O9和O10在該分支中單獨聚在一個小的分 支內。

圖3 基于BCoV N蛋白區域構建的系統發育樹

2.3.3 BNoV 對18個BNoV陽性樣品的RdRp基因PCR產物進行測序，結果表明，獲得的18個序列中有12個核苷酸序列不一致，分別為A6、F7、F9、F11、F12、I1、I6、I7、I8、I10，J5和J6。BLAST分析結果表明，所有序列都與GeneBank中已公布的BNoV GⅢ.2型RdRp基因的同源性最高，核苷酸序列一致性為87.6%～ 98.4%。遺傳進化分析結果如圖4所示，獲得的12個BNoVRdRp基因與GeneBank中已公布的GⅢ.2型BNoV遺傳進化距離最近。其中A6、F7、F9、F11、F12、I1、I6、I7、I8和I10等與中國株(Bo/SCZ-18/CH)等聚在同一個分支上，J5與韓國株(Bo/MG-16/KOR)聚為一支，J6單獨聚為一支，但與中國株(Bo/MI-48/CH)遺傳進化距離較近。

圖4 基于BNoV RdRp區域構建的系統發育樹

2.3.4 隱孢子蟲 對10個陽性樣本的隱孢子蟲SSU區域PCR產物進行測序，測序結果表明，獲得的10個序列中有6個核苷酸序列不一致，分別為D1、D5、F2、H4、W2和W9。BLAST分析結果表明，D1、D5、F2和W9序列與GeneBank中已公布的微小隱孢子蟲(Cryptosporidiumparvum)SSU基因的同源性最高，核苷酸序列一致性為95.7%～98.4%；H4、W2與GeneBank中已公布的牛隱孢子蟲(Cryptosporidiumbovis)SSU基因的同源性最高，核苷酸序列一致性為98.5%和99.5%。遺傳進化分析結果如圖5所示，D1、D5、F2和W9樣本序列與GeneBank中已公布的微小隱孢子蟲遺傳進化距離最近，H4、W2與GeneBank中已公布的牛隱孢子蟲遺傳進化距離最近。其中D1、D5、F2、W9等與微小隱孢子蟲日本株(Ca/NCD01/JAN)、伊朗株(Bo/CPOA5/IRA)、中國株(Bo/245/CH)單獨聚為一支；W2與牛隱孢子蟲中國株(Bo/C90/CH、Ya/DR-2/CH)聚為一支；H4與牛隱孢子蟲土耳其株(Bo/AF_CR07/TUR)、中國株(Bo/ECOST23057/CH、Bo/151/CH和Bo/GS-15/CH)、孟加拉國株(Bo/GC2/BAN)聚為一支。

圖5 基于隱孢子蟲SSU區域的系統發育樹

3 討 論

3.1 新生犢牛腹瀉的日齡特點

新生犢牛由于胃腸道結構發育不成熟、腸道物理屏障和生物屏障不完整、機體免疫機能不完善等原因極易受到病原體侵襲，進而發生腹瀉[21]。新生犢牛日糧以牛奶為主，在犢牛出生后，如果初乳飼喂不及時、常乳消毒不徹底或飲水不清潔等都可引起NCD。此外，犢牛攝入的牛奶可為感染性病原(如BRV等)提供良好的腸道生存環境，有利于感染性病原的生存[22]。據美國乳業國家動物健康監測系統報告稱，NCD多發生于1月齡以下犢牛[23]。Foster等[5]研究表明，腹瀉多發于斷奶前犢牛，且以1月齡以內犢牛最為常見。本研究中腹瀉犢牛主要集中在1月齡內，日齡越小腹瀉犢牛占比越高，與Foster等[5]研究結果一致。

3.2 寧夏NCD主要病原的流行特點

王文佳等[14]研究表明，寧夏地區腹瀉犢牛的BRV、K99型大腸桿菌、隱孢子蟲和賈第鞭毛蟲等的檢出率分別為32.28%、11.02%、25.20%和4.72%，腹瀉犢牛以單一病原感染為主。李復煌[24]研究表明，北京地區犢牛腹瀉感染類型以單一感染為主，輪狀病毒和隱孢子蟲是最主要的混合感染類型。這與本研究檢測結果部分一致。國內外普遍認為引起犢牛腹瀉的主要病原為BRV、BCoV、K99型大腸桿菌和隱孢子蟲，而本研究結果表明寧夏地區引起NCD的主要病原為BRV、BNoV、BCoV和隱孢子蟲，檢出率分別為 19.8%、12.26%、9.43%和6.6%。BNoV是近年來新發現的一種病原，Cho等[21]研究表明，BNoV可侵入空腸、回腸和結腸遠端上皮細胞，引起腸道上皮隱窩和小腸絨毛細胞萎縮、壞死，減少腸道可吸收面積，進而引起腹瀉。王玥琳等[12-13]研究表明，腹瀉糞便樣本中BNoV的檢出率顯著高于健康糞便樣本，中國四川、遼寧、河南、山東、陜西等地腹瀉犢牛BNoV的檢出率分別為 34.78%、75%、11.11%、9.09%、0。本研究中，半數以上的牧場中均檢出BNoV，且檢出率較高，表明BNoV已經在寧夏奶牛場中廣泛流行。

中國犢牛腹瀉發病率為9.6%～60.0%[4]，但已有的研究多未對斷奶前和斷奶后的犢牛腹瀉進行嚴格區分，斷奶前犢牛腹瀉的病原感染情況并未明確。實際生產中，斷奶前犢牛與斷奶后犢牛的飼養方式和養殖環境明顯不同，斷奶前犢牛均在獨立牛棚單獨飼喂，接觸病原的機會相對較低，且初乳飼喂為新生犢牛的早期階段提供了有效的被動免疫。而斷奶后犢牛一般混群飼喂，接觸病原機會增多，腸道病原組成可能更為復雜。因此，斷奶前與斷奶后犢牛腸道感染的病原類型和感染類型可能會有所不同。據報道，BRV和BCoV主要感染3周齡以內的犢牛[25]，隱孢子蟲主要感染15～21 d犢牛[26]，BNoV主要感染2月齡內日齡較小犢牛[27]，與本研究統計結果基本 相符。

3.3 NCD主要病原分子特征

根據輪狀病毒VP6內殼多肽的特異性，輪狀病毒被分為A、B、C、D、E、F和G等7個血清型，犢牛感染的輪狀病毒主要為A型[28]。VP6基因的遺傳進化分析結果表明，本研究檢測到的輪狀病毒均屬于A型，大部分毒株與中國河北株(Bo/HB-BD/CH)聚在一支，提示本研究得到的大部分寧夏流行株與河北地區流行株同源。輪狀病毒可跨種感染，BRV可感染人，并與人輪狀病毒發生重組[29-30]，本研究中的Y7株與人糞便分離到的美國株(Hu/2011825363/USA)聚為一支，提示該地區存在可感染人的BRV流行株，因此，加強BRV的研究具有一定的公共衛生學意義。

BCoV中編碼核衣殼蛋白的N蛋白基因高度保守，常作為BCoV檢測的靶基因[31]。N蛋白的遺傳進化分析結果表明，本研究檢測到的核苷酸序列為BCoV N蛋白基因序列，與中國四川報道株(Bo/SC1/CH)和美國株(Bo/4-17-08/USA)遺傳距離較近[32]，提示寧夏地區BCoV流行株可能存在國內和國際兩種傳播途徑，應當加強本地區BCoV流行趨勢的監控。

諾如病毒可分為GⅠ、GⅡ、GⅢ、GⅣ、GⅤ和GⅥ基因型，已報到感染牛的諾如病毒為GⅢ型，該型不感染人[33]。GⅢ型BNoV又可分為GⅢ.1型和GⅢ.2型，臨床上以GⅢ.2型為主，但感染GⅢ.1型BNoV的病牛臨床癥狀更為明顯[25]。通過RdRp基因的遺傳進化分析可對諾如病毒進行分型鑒定[34]。BNoVRdRp基因的遺傳進化分析結果表明，本研究中檢出的BNoV全部為GⅢ.2型，與GeneBank中收錄的BNoV的RdRp片段核苷酸一致性為87.6%～98.4%。王玥琳[13]在河南、四川等地區檢出的BNoV大部分為GⅢ.2型，小部分為GⅢ.1型，本研究中尚未檢出GⅢ.1型BNoV。由于BNoV為寧夏地區首次檢出，且檢出率較高，未檢出GⅢ.1型BNoV，提示應該進一步擴大該地區BNoV流行株的研究，這將對NCD的防控提供參考依據。

隱孢子蟲是引起犢牛腹瀉的最主要寄生蟲，中國已報道的可引起犢牛腹瀉的隱孢子蟲包括瑞氏隱孢子蟲(C.ryanae)、牛隱孢子蟲、微小隱孢子蟲、安氏隱孢子蟲(C.andersoni)和人隱孢子蟲(C.hominis)等，其中牛隱孢子蟲是優勢種，其次是微小隱孢子蟲[35]。高海慧等[15]報道寧夏地區感染奶犢牛的隱孢子蟲主要為牛隱孢子蟲、微小隱孢子蟲和瑞士隱孢子蟲，而本研究中檢測到的隱孢子蟲為牛隱孢子蟲和微小隱孢子蟲，其中微小隱孢子蟲檢出率較高。但高海慧[15]的研究中未對犢牛進行嚴格區分，而斷奶后犢牛為混群飼喂，感染隱孢子蟲種類可能更多，所以本研究中檢測到的隱孢子蟲種類較少。據Li等[36]報道，微小隱孢子蟲的檢出率與犢牛日齡有關，斷奶前新生犢牛糞便中微小隱孢子蟲的檢出率高于其他種，與本研究檢測結果一致。但本研究得到的6株隱孢子蟲流行株聚類較為分散，表明該地區內隱孢子蟲具有豐富的遺傳多樣性，提示其演化方向較廣，需要進一步擴大探究。

4 結 論

本研究對寧夏部分地區主要奶牛養殖園區斷奶前新生犢牛進行腹瀉的主要相關病原檢測，對主要病原的分布和感染特點、遺傳進化特征進行分析。流行病學調查結果表明，腹瀉主要發生于30日齡內犢牛，BRV、BCoV、BNoV和隱孢子蟲是造成該地區斷奶前犢牛腹瀉的主要病原，感染形式以單一病原感染為主，BRV和BNoV檢出率相對較高，其中BNoV在寧夏地區首次檢出。遺傳進化分析結果表明，寧夏部分地區新生犢牛檢出的BRV、BCoV與國內已報到的毒株基本一致，BNoV主要為GⅢ.2型，隱孢子蟲主要為微小隱孢子蟲，研究結果為寧夏地區新生犢牛腹瀉的防控提供重要參考。