不同輸精時(shí)間對(duì)湖羊胚胎采集效果的影響

高 峰，李心海*，王 巖

（1.徐州生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 徐州 221000； 2.江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司，江蘇 徐州）

湖羊是我國(guó)一級(jí)保護(hù)地方畜類(lèi)品種，主要養(yǎng)殖于江浙地區(qū)。湖羊具有早熟、一年四季均可發(fā)情、普遍每胎多羔、泌乳性能優(yōu)良、生長(zhǎng)發(fā)育速度快、耐熱耐濕等優(yōu)良性狀，而且湖羊肉質(zhì)細(xì)膩，其裘皮尤其是羔羊皮質(zhì)地柔軟、花紋優(yōu)美，深受消費(fèi)者的歡迎，是一種適宜廣泛舍飼的優(yōu)良品種[1-5]。近年來(lái)，羊腹腔鏡輸精技術(shù)已在生產(chǎn)中推廣應(yīng)用，尤其在引種和擴(kuò)繁等方面發(fā)揮著重要作用。由于湖羊具有良好的繁殖性能、母性好、體質(zhì)健壯和抵抗不良環(huán)境能力強(qiáng)，因此，湖羊一般作為一些高產(chǎn)綿羊胚胎移植的受體使用。為了進(jìn)一步利用新技術(shù)開(kāi)發(fā)湖羊繁殖優(yōu)勢(shì)，所以進(jìn)行本次試驗(yàn)，以期為后續(xù)湖羊繁殖技術(shù)改良提供一些基礎(chǔ)參考資料，加快湖羊繁殖新技術(shù)的廣泛推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)?zāi)秆蜻x擇年齡在1～2歲 齡，體重50 kg左右，膘情良好，無(wú)生殖道疾病的經(jīng)產(chǎn)湖羊母羊30只。試驗(yàn)公羊選擇體格健壯，性欲旺盛，體重60 kg左右，無(wú)生殖道疾病的湖羊公羊5只。試驗(yàn)前，B超檢查母羊是否懷孕，15 d后再檢查1次。母羊與公羊分開(kāi)飼養(yǎng)。

1.1.2 藥品與儀器羊用陰道栓（CIDR，南非ZOETIS公司生產(chǎn)），規(guī)格：每包20支，每支含0.3 g孕酮；獸用孕馬血清（PMSG，寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn)），規(guī)格：1 000 IU/瓶，批號(hào)110914564；氯前列烯醇（PGF2α，寧波三生生物科技有限公司生產(chǎn)），規(guī)格：2 ml，0.2 mg/瓶，批號(hào)110912207；促卵泡素（FSH，寧波第二激素廠(chǎng)）規(guī)格：100 IU/瓶，批號(hào)110254629，4 ℃ 條件保存。

試驗(yàn)儀器包括沖胚管、母羊保定臺(tái)、恒溫水浴鍋、腹腔，體視顯微鏡、開(kāi)膣器、子宮鉗、集精杯、手術(shù)剪、醫(yī)用噴壺、止血鉗、注射器、液氮罐、培養(yǎng)皿、手術(shù)刀片、手術(shù)架、醫(yī)用縫合線(xiàn)、留置針、鑷子、記號(hào)筆等。

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理精料選擇全價(jià)顆粒料，粗料選擇苜蓿、花生秧、秸稈等青貯飼料。每天上午8時(shí)、下午5時(shí)各飼喂1次，置自動(dòng)飲水器飲水，羊自由舔食。種公羊加飼胡蘿卜和雞蛋，正常采精鮮精，并檢查精液活力，活力在0.7以上時(shí)才可使用。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥本次試驗(yàn)開(kāi)展于2021年10～11月間，地點(diǎn)在江蘇漢羊牧業(yè)生態(tài)科技有限公司養(yǎng)殖基地。

試驗(yàn)發(fā)情母羊共30只，均進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理，處理過(guò)程中不分組。

同期發(fā)情與超數(shù)排卵處理：對(duì)所有母羊采用CIDR+PMSG+PG+FSH法進(jìn)行同期發(fā)情和超數(shù)排卵處理。埋栓當(dāng)天記為第1日，每只母羊都埋栓13 d，第11天下午開(kāi)始肌注FSH，每隔12 h注射1次，連續(xù)注射7次FSH，劑量逐漸遞減，F(xiàn)SH總劑量為400 IU/只，第13天下午注射FSH的同時(shí)，每只羊注射PMSG200單位，第14天上午取栓的同時(shí)肌肉注射PG0.1 mg。

不同輸精時(shí)間沖胚效果試驗(yàn)過(guò)程：將經(jīng)過(guò)同期發(fā)情和超排處理的發(fā)情母羊隨機(jī)分為3組，每組10只，采用相同輸精密度，不同輸精時(shí)間進(jìn)行腹腔鏡子宮角授精。根據(jù)輸精時(shí)間分組如下：Ⅰ組（撤栓后48 h）、Ⅱ組（撤栓后54 h）、Ⅲ組（撤栓后60 h）；每只母羊輸入0.2 ml精液，活力在0.7以上。

腹腔鏡子宮角輸精：穿刺部位一般選擇在母羊乳頭前方14 cm左右，腹中線(xiàn)兩側(cè)各穿刺1孔，見(jiàn)圖1乳頭下方黑點(diǎn)所在位置[6,7]。在左側(cè)乳頭前方14 cm左右，偏離腹中線(xiàn)左側(cè)3～4 cm處插入0.7 cm的套管針，刺穿皮膚深度2 cm，將套管送入腹腔（注意不要將套管針頭刺入太深，以免刺穿其他內(nèi)臟部位）。通過(guò)套管往腹腔內(nèi)部充入適量氣體，然后關(guān)閉氣閥，其目的是壓迫內(nèi)臟向前，暴露卵巢和子宮角。向腹腔內(nèi)伸入帶有冷光源的內(nèi)窺鏡，觀察卵巢上卵泡狀態(tài)以及數(shù)量。此時(shí)，在右側(cè)相同位置處插入套管針，拔針后通過(guò)套管插入輸精槍。如果卵巢上有多個(gè)卵泡或排卵點(diǎn)時(shí)即可輸精，若沒(méi)有卵泡或排卵點(diǎn)則不必輸精。找到子宮角分叉處，在一側(cè)子宮角距離分叉1/3處，輸精槍前端針頭刺入到子宮角內(nèi)，應(yīng)感覺(jué)到有阻力，緩慢注射1/2精液量，然后拔出針頭，將剩余精液注入到另一側(cè)子宮角相應(yīng)位置，完成輸精。

圖1 腹腔鏡輸精穿刺部位

胚胎的采集：授精后第6天對(duì)供體湖羊采卵。手術(shù)前對(duì)供體湖羊肌肉注射鹿眠寧1 ml/只。在靠近乳房的腹部作一縱行切口，用食指和中指夾住子宮角并拉出腹腔外，用生理鹽水沖洗一下，用滅菌的回形針刺破子宮角壁，并從此處插入套管針，將針芯抽出，再用回形針刺破子宮角另一端，并在此處插入沖胚管。用注射器向沖胚管內(nèi)注入適量水，能夠?qū)⒆訉m角撐開(kāi)，但不能將子宮角壁撐破，在沖胚管的另一端用集卵皿收集胚胎。用注射器吸取生理鹽水從套管處注入進(jìn)行沖胚，并在沖胚管的末端收集沖胚液，然后用注射器將水囊的水抽完，從子宮角抽出沖胚管，沖洗子宮并放回腹腔，縫合腹壁，手術(shù)完成后肌肉注射鹿醒寧1 ml，并肌肉注射青鏈霉素以防發(fā)生感染。

檢胚：將沖胚液靜置10 min，在室溫下用體視顯微鏡放大20倍檢胚。先用吸管吸取上清液并棄掉，再用吸管將胚胎轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)皿中，反復(fù)尋找胚胎，將所有胚胎檢出。

1.2.3 數(shù)據(jù)計(jì)算沖胚數(shù)包括未受精卵和受精卵形成受精胚胎的總數(shù)。受精率=受精胚胎數(shù)/沖胚數(shù)×100 %?？捎门咛ヂ?可用胚胎/受精胚胎數(shù)×100 %。

用Excel 2003軟件記錄試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行整理，用SAS軟件中的PROCFREQ程序進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

由表1可知，不同輸精時(shí)間對(duì)供體母羊腹腔鏡子宮角輸精后的沖胚結(jié)果有一定影響。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組沖胚數(shù)最高為146枚，最低為132枚；受精胚胎數(shù)最高為139枚，最低為118枚；卵子受精率最高為95.21 %，最低為83.10 %。受精胚胎中的可用胚胎數(shù)最高為122枚，最低為93枚；可用胚胎率最高為 87.78 %，最低為78.81 %。表1數(shù)據(jù)可見(jiàn)，Ⅲ組（60 h）與I、II組相比，無(wú)論在卵子受精率和可用胚胎率上均存在顯著性差異（P＜0.05），I組和II組之間不存在顯著性差異（P＞0.05）。

表1 不同輸精時(shí)間對(duì)供體母羊沖胚的影響

3 討論

近年以來(lái)，隨著腹腔鏡子宮角輸精技術(shù)的成熟和發(fā)展。優(yōu)良種畜的利用率越來(lái)越受到重視。在技術(shù)水平相同條件下，I組與II組提高種公羊的精液利用率，就顯得尤為重要了。

不同輸精時(shí)間對(duì)綿羊胚胎移植供體沖胚效果的影響。從本次研究結(jié)果來(lái)看，撤栓后48 h和54 h的腹腔鏡輸精在卵子受精率和可用胚胎率上差異不顯著，但是要高于撤栓后60 h，且差異顯著。高志英、霍飛、艾尼阿木提[8]等在對(duì)多浪羊的研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后48 h采用凍精進(jìn)行陰道輸精，受胎率達(dá)到24.52 %。肖西山[9]在對(duì)小尾寒羊研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后48～60 h采用鮮精連續(xù)陰道輸精兩次，受胎率達(dá)到68.33 %。韓旭飛、盧小芳[10]等在對(duì)東北細(xì)毛羊的研究中發(fā)現(xiàn)撤栓48h后，腹腔鏡輸精受胎率達(dá)到89.9 %。王晶晶[11]在對(duì)美利奴羊研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后48 h腹腔鏡輸精受胎率達(dá)到90 %，要遠(yuǎn)高于撤栓后24 h、36 h和72 h。趙霞、馬躍軍、李玉榮[12]等對(duì)綿羊腹腔鏡輸精研究中發(fā)現(xiàn)，撤栓后46～58 h獲得的受胎率在89.92 % ～ 97.44 %，遠(yuǎn)高于其他時(shí)間段的受胎率。張靜、焦熙尭、高曉茜[13]等在對(duì)烏珠穆沁羊腹腔鏡輸精研究中發(fā)現(xiàn)最佳輸精時(shí)間應(yīng)在撤栓后48～58 h之間，受胎率在92.4 % ～ 94.8 %。從以上研究報(bào)道可見(jiàn)，無(wú)論是陰道和子宮頸輸精還是腹腔鏡輸精，輸精時(shí)間大致在36～58 h之間，與本次試驗(yàn)結(jié)果基本一致。綿羊排卵基本發(fā)生在發(fā)情結(jié)束前后，精子維持受精時(shí)間在3 d左右，卵子維持受精的時(shí)間較短在5 h左右，而綿羊同期發(fā)情大致在撤栓以后的48 h左右。相比傳統(tǒng)輸精方式，腹腔鏡輸精節(jié)省優(yōu)質(zhì)精液的使用量和精子的運(yùn)行時(shí)間。從本次試驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，在撤栓后48～54 h之間輸精可以使可用胚胎率達(dá)到87.78 %，有效地保證了輸精效果。但是，本次試驗(yàn)僅涉及到鮮精的使用，對(duì)于不同時(shí)間段冷凍精液對(duì)腹腔鏡子宮角輸精的效果還有待于研究。

4 結(jié)論

近些年，羊的腹腔鏡輸精技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，而精液品質(zhì)的好壞，關(guān)系到此項(xiàng)技術(shù)成功推廣的關(guān)鍵。最佳輸精時(shí)間是推廣腹腔鏡輸精技術(shù)、擴(kuò)大優(yōu)質(zhì)公畜利用率關(guān)鍵技術(shù)之一。輸精時(shí)間過(guò)早母羊未及時(shí)排卵，卵子不夠成熟；輸精時(shí)間過(guò)晚卵子會(huì)出現(xiàn)退化，同樣難以完成受精作用。本次研究通過(guò)分析不同輸精時(shí)間對(duì)鮮精腹腔鏡子宮角輸精效果，認(rèn)為：在腹腔鏡子宮角輸精技術(shù)背景下，最佳輸精時(shí)間宜在撤栓后48～54 h之間。通過(guò)最佳輸精時(shí)間的設(shè)置，可以大大提高優(yōu)秀種公羊的利用率和覆蓋面，降低種公羊的飼養(yǎng)規(guī)模，從人力、物力等多方面節(jié)約了成本，給羊場(chǎng)帶來(lái)更大的經(jīng)濟(jì)效益。