豬呼吸道病原綜合診斷

李 昊，周可磊，陳世云，周 軍，馬艷君，羅 鳳

（1.西昌學院，四川 西昌 615013；2.四川省涼山彝族自治州農業農村局，四川 西昌； 3. 四川省西昌市農業農村局，四川 西昌；4.四川博策檢查技術有限公司，四川 成都）

呼吸系統疾病、消化系統疾病和繁殖障礙性疾病是危害養豬業健康發展的最常見的三類疾病，其中豬呼吸道類疾病發生最為普遍，發病率30 % ～ 80 %，死亡率在5 % ～ 30 %，呼吸道疾病可發生在豬的各個日齡段[1]。隨著我國養豬集約化程度的提高、氣候的劇變以及環境中病原菌耐藥性的增強，進一步加重了豬場豬呼吸道疾病發生[2-3]。在豬呼吸系統疾病發生過程中，免疫抑制性病毒如豬圓環病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）和豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine respiratory and reproductive syndrome virus， PRRSV）的感染或者潛伏感染是重要的病因之一，該類病毒能夠抑制機體免疫，導致機體免疫力下降，為其他細菌性病原的的感染提供有利條件[4]。

豬圓環病毒病是由PCV-2引起的豬的一種免疫抑制的傳染病，其臨診主要特征為消瘦、黃疸、體質下降、呼吸困難、腹瀉、母豬繁殖障礙、內臟器官及皮膚的廣泛病理變化[5]。目前認為，PCV-2可以感染豬的一生，不同生產階段的豬感染后臨床表現不同，但是對成年豬感染后一般呈亞臨床狀態，并成為重要傳染源之一[6]。豬巴氏桿菌病（Swine pasteurellosis）又稱豬肺疫，是由多殺性巴氏桿菌（Pm）引起豬的出血性敗血癥，是一種急性、熱性傳染病。急性型呈出血性敗血癥，呼吸極度困難[5]。慢性型多見于流行后期，主要呈現慢性肺炎或慢性胃腸炎癥。時發腹瀉，呈進行型營養不良，極度消瘦最后衰竭致死，給養豬業帶來極大危害[7]。

2021年3月，四川省西昌市某育肥豬場發生以呼吸道障礙為特征的疫病，發病率高達35 %，死亡率約為8 %。為了準確診斷引起本次豬呼吸道疾病的病原以及篩選出有效藥物，本試驗進行了病原的分子檢測、細菌分離鑒定與藥敏試驗，篩選出了針對該致病菌的敏感藥物，并有針對性地提出了治療和防控措施，為發病豬場疾病的診斷和制定有效的防治措施提供了參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本從發病場無菌采集3頭疑似呼吸系統疾病癥狀的病死豬肺組織、淋巴結和扁桃體樣品放入冰盒，由四川博策檢查技術有限公司進行檢測。

1.1.2 主要試劑和儀器總核酸提取試劑盒購自臺灣瑞基海洋生物科技有限公司，胰蛋白胨大豆瓊脂，抗菌藥物藥敏紙片及微量生化反應管購自杭州微生物試劑有限公司；反轉錄試劑盒、2XTaq PCR Master Mix、DNA分子量標準DL2000購自寶生物工程（大連）有限公司。

用到的主要儀器有：全自動核酸提取儀（金瑞鴻捷（廈門）生物科技有限公司）、ABI PCR儀（賽默飛世爾（上海）儀器有限公司）、君意凝膠成像儀（北京君意東方電泳設備有限公司）、恒溫培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）、高壓滅菌鍋（馳通儀器（上海）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細菌和病毒的PCR/RT-PCR鑒定將3頭病死豬（分別編號1、2、3）對應編號的肺臟、淋巴結和扁桃體等組織進行等體積混合，加入滅菌生理鹽水進行研磨，反復凍融3次，8 000 r/min 離心2 min。取上清液200 μl進行核酸提取，根據總核酸提取試劑盒進行核酸提取，運用常規PCR和RT-PCR方法進行檢測，其中，采用16 S通用引物擴增的產物送至生物公司測序。所用引物均由上海生工生物科技有限公司合成，詳細序列見表1。

表1 引物序列信息

1.2.2 細菌分離和生化鑒定選取肺組織病變嚴重部位并置于超凈臺中，用酒精棉對其表面消毒，用無菌手術剪取深部組織并涂布于含有5 %新生牛血清的TSA平板上，接種環劃線，置于37 ℃ 恒溫箱中培養12～48 h后進行肉眼觀察，挑取優勢單菌落接種于含有5 % 新生牛血清的TSB液體培養基中，在160 r/min、37 ℃ 搖床中進行純化培養。分別勾取純培養物無菌接種于生化試驗培養基中，37 ℃ 培養24～48 h后判定結果。

1.2.3 細菌藥敏實驗將純化成功的菌種采用滅菌生理鹽水進行清洗，稀釋后并與麥氏比濁管比濁后選取濃度為3×108個活菌/ml，吸取0.1 ml菌液均勻涂布在整個血清瓊脂培養基上，在超凈工作臺中干燥3～5 min后貼上杭州微生物試劑有限公司的藥敏紙片（青霉素、阿莫西林、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢哌酮、頭孢曲松、新霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、硫酸新霉素、慶大霉素、鏈霉素、恩諾沙星、環丙沙星、強力霉素、諾氟沙星），于37 ℃ 培養18～24 h后根據說明書的判定標準確定藥敏結果。

2 結果與分析

2.1 病豬病理剖檢變化

發病豬群精神沉郁、體溫升高、呼吸困難、口鼻流白色泡沫。剖檢發現氣管內有大量泡沫黏液（圖1A），肺臟充血、出血、淤血（圖1B）。

圖1 病豬病理剖檢變化

2.2 細菌和病毒的PCR/RT-PCR鑒定

病原分子檢測結果表明3頭豬均呈PCV-2陽性，而PRRSV、PRV和CSFV呈陰性，結果見圖2；表明發病豬群主要為PCV-2感染。

圖2 病原PCR/RT-PCR檢測結果

2.3 細菌的分離鑒定

肉眼觀察菌落呈灰白色、光滑、濕潤的菌落；挑取單菌落進行革蘭氏及瑞氏染色，革蘭氏染色呈陰性細小桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染的細菌。在麥康凱瓊脂平板上不生長，生化試驗結果為葡萄糖、蔗糖、果糖陽性，乳糖、阿拉伯糖、吲哚陰性，硝酸鹽還原試驗陽性，甲基紅、石蕊、枸櫞酸鹽利用試驗陰性，初步鑒定為多殺性巴氏桿菌。為了進一步確定病原，用16S通用引物檢測細菌，結果擴增到1465bp目的片段，將該片段純化后進行測序，測序結果與NCBI Blast序列比對分析，該分離菌為巴氏桿菌。

圖3 16S rRNA PCR檢測結果

以上結果表明導致本場本次發病的病原為PCV-2和巴氏桿菌混合感染。

2.4 分離菌藥敏試驗

如表2所示，分離菌株對頭孢曲松、諾氟沙星、環病沙星、丁胺卡那等13種藥物表現出了不同程度的敏感性，其中高敏藥物10種，中敏藥物3種，耐藥藥物3種（青霉素、阿莫西林和氟苯尼考）。

表2 分離菌株對16種藥物的敏感性

3 討論

目前我國許多養豬場呼吸道疾病病原復雜，臨床生產中多以混合感染和繼發感染為主[8]。引起豬呼吸道疾病原發性病原主要有PCV-2、PRRSV、PRV、CSFV、胸膜肺炎放線桿菌和豬肺炎支原體等，繼發性病原主要有巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌和豬鏈球菌等，尤其是PCV-2和PRRSV感染肺泡巨噬細胞，可引起嚴重免疫抑制，造成呼吸系統抵抗力下降，導致豬繼發感染等[9]。此外豬場濫用抗生素導致許多細菌產生耐藥性，致使發病后抗菌藥物治療效果不佳甚至無效果，造成嚴重經濟損失[9]。

豬群攜帶圓環病原是PCV感染的必要條件，在飼養管理不善、通風不良、溫濕度不適、免疫接種應激、不同來源和日齡的豬群混養等原因可綜合導致豬群出現明顯的臨床癥狀病帶來較大的經濟損失。PCV感染引起免疫抑制，造成呼吸系統抵抗力下降，進而導致豬群易繼發巴氏桿菌感染[10]。豬場可采取以下措施防控圓環病毒感染豬群：分區飼養，全進全出；加強疫苗的免疫，選擇針對該場現有毒株的高抗原含量疫苗，制定合理的疫苗免疫程序；加強生物安全措施，避免交叉感染[11]。

巴氏桿菌廣泛存在于正常豬的上呼吸道、扁桃體等器官和組織中，因而豬群巴氏桿菌的帶菌率與豬群是否發生豬巴氏桿菌病并無直接關系[12]。一般認為動物在發病前已經帶菌，當各種誘因使機體抵抗力降低時，病原菌即可乘虛侵入體內，經淋巴液進入血流，發生內源性感染[5]。目前，臨床上控制豬巴氏桿菌病最有效、最快速的方法是使用抗菌藥物進行治療，但是隨著抗菌藥物大量、盲目的濫用，細菌的耐藥性亦越來越嚴重，給食品安全和人類健康造成潛在的威脅。王久紅等[13]研究表明，豬巴氏桿菌分離株對對大部分抗生素敏感，尤其是恩諾沙星、環丙沙星等沙星類抗生素，而鏈霉素、慶大霉素等藥物對其抑制效果不明顯，僅對林可霉素產生耐藥性。胡星星等[14]研究表明，豬巴氏桿菌部分分離株對強力霉素、青霉素類、磺胺類、氨基糖苷類藥物的耐藥率相對較高，而對對氧氟沙星、多粘菌素B、頭孢類和阿莫西林相對敏感。本研究中的分離菌株對多種藥物高度敏感，為發病豬場篩選出了治療性藥物，但是本研究中的分離菌株已對3種藥物產生了不同程度的耐藥性。綜合以上研究結果可以看出，豬巴氏桿菌在不同地域分離株對不同藥物均已產生了一定的耐藥性，其整體耐藥性的發展趨勢不容樂觀，應加強重視。

豬場呼吸道疾病是威脅豬群健康和導致經濟嚴重損失的主要疾病，本案例對豬出現明顯的呼吸道等癥狀的病原進行檢測，為PCV-2和巴氏桿菌混合感染所致，在此結果基礎上，采取了將發病豬隔離，避免疫情擴散，緊急免疫。豬場使用高抗原含量的PCV-2疫苗進行緊急免疫，需注意一豬一針頭。同時建議使用頭孢曲松等高度敏感類藥物進行肌肉注射，連續治療3～5 d，觀察患病豬的恢復情況或用恩諾沙星連續拌料5 d，停藥7 d后使用環丙沙星連續拌料5 d，均按說明書劑量使用，或用用恩諾沙星飲水連續給藥5 d，用于保健和預防。給藥前豬群停水2 h，再讓豬群自由飲用。同時加強環境消毒和飼養管理，實行全進全出生產模式，禁止混群，對發病豬及時隔離，并對病死豬進行無害化處理。加強消毒，每批次豬群轉移后充分消毒并空欄7 d。加大空氣流通，降低豬舍內氨氣含量，改善欄舍空氣質量。加強對飼養人員的管理，避免串欄，在進入豬舍前一定要消毒。通過以上措施，快速控制了疫情，降低了豬群的死亡率，為豬場挽回了損失。

現階段，非洲豬瘟給我國養豬業造成了極大的損失，豬場應提高生物安全防控意識，及時隔離發病豬只，并做好消毒工作，在防控非洲豬瘟的同時，加強對PRRSV、PCV-2和PRV等病毒性病原的防控，凈化這些疫病，提高豬場效益。本案例通過實驗室診斷和豬場獸醫的臨床診斷結合，做出了合理的綜合診斷。并根據檢測結果，制定了一系列針對性的治療及防控措施，通過連續跟蹤回訪，顯示該措施切實可行，為豬場圓環病毒和巴氏桿菌病的診斷和防控提供了基本原則和數據上的支持。