基于16S rDNA擴增子測序技術分析豬乳汁中微生物菌落多樣性

劉 麗，聶曉彤，黃 迪，劉兆敏，李 夢

（德州學院生物物理研究院，山東 德州 253023）

作為我國農業和國民經濟的重要基礎，生豬養殖一直受到廣泛關注。目前針對仔豬已展開大量研究，但主要集中于斷奶后仔豬營養、疾病預防等方面，對哺乳期仔豬的研究相對較少[1]。哺乳期是仔豬生長發育最快、最易患病死亡的時期[2]，對該階段進行研究可為生豬養殖提供理論指導。

乳汁是哺乳期仔豬的主要食物，其成分對仔豬的生長發育具有重要影響。目前對乳汁的報道主要集中在乳鐵蛋白、免疫蛋白和脂肪酸等生物活性物質[3]，但此外，乳汁中還含有豐富的微生物[4]。已證實，母仔之間可通過母乳途徑進行微生物垂直傳遞[5]，這些微生物構成子代腸道微生物的先鋒菌群，在一定程度上決定了子代腸道菌群的形成與發展[6]。因此，本研究以養殖場常見豬種大白豬和皮特蘭豬為模型，通過高通量測序研究豬乳不同泌乳階段乳汁微生物的變化，為進一步研究仔豬飼料中的益生菌添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇山東省新希望六和農牧公司兩品種（大白、皮特蘭）具有相似預產期的健康母豬各8只，于妊娠第113天的上午9:00肌內注射氯前列醇（每頭母豬0.2 mg）確保同步生產。分別在第0天（分娩當天）和第7天收集每頭母豬乳汁，按照大白豬初乳、大白豬成熟乳、皮特蘭豬初乳、皮特蘭豬成熟乳分為4組，依次編號為：YC、YM、PC、PM，置于液氮中隨后儲存于 -80 ℃ 冰箱保存備用。

1.2 方法

1.2.1 乳汁樣本總DNA提取每個樣本各取800 μl加入1.5 ml離心管中，于12 000 g離心機離心10 min，棄上清液。使用Easy Pure? Micro Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒提取總DNA，采用1 % 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 PCR反應和高通量測序委托上海美吉生 物醫藥科技有限公司進行后續PCR反應及上機測序。測序引物為515F：5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'，測序區域為V4區，測序平臺是Illumina MiSeq。

1.2.3 生物信息學分析通過Usearch 11進行97 % OTU聚類，并生成特征表，與Silva數據庫比對，得到注釋結果，利用Mothur軟件和Qime軟件分別進行菌群α多樣性和β多樣性分析。

2 結果

2.1 乳汁微生物樣本測序及聚類分析結果

利用16S rDNA測序技術對樣本進行序列測定，獲得2390391條高通量序列，長度在221 bp～260 bp之間。OTU聚類結果表明，所測數據片段可以聚類成11 165個OTU，分布于68個門（phylum）、149個綱（class）、405個目（order）、783個科（family）、1 933個屬（genus）和4 329個種（species）（圖1）。

圖1 乳汁微生物運算分類單元維恩分析圖

2.2 乳汁微生物樣本多樣性分析

采用t檢驗計算乳汁微生物豐富度指數（Chao1）和多樣性指數（Shannon）。由表1可知，成熟乳微生物群落的Chao1和Shannon指數較初乳降低，說明隨著時間的增加，乳汁菌群多樣性和豐富度降低。PCoA主坐標分析發現，成熟乳組與初乳組樣本離散程度較大，表明母豬不同泌乳階段乳汁菌群結構差異較大。

表1 樣本Alpha多樣性統計

圖2 各組乳汁微生物PCoA主坐標分析圖

2.3 乳汁微生物組成分析

2.3.1 門水平

16S rDNA測序結果表明，母豬乳汁細菌群落在門水平上以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主（表2）。與初乳相比，成熟乳中變形菌門豐度較高，而厚壁菌門和放線菌門豐度較低，擬桿菌門在大白豬乳汁中豐度較低，而在皮特蘭豬乳汁中豐度較高。上述結果表明母豬乳汁菌群中優勢門的種類及豐度隨時間的變化而呈現不同程度的變化。

表2 乳汁成熟度對微生物群落優勢門相對豐度的影響

在大白母豬不同泌乳階段，變形菌門相對豐度隨著時間變化而顯著增加（P＜0.05，下同），其他菌門變化不顯著；在皮特蘭母豬不同泌乳階段，厚壁菌門相對豐度隨著時間極顯著減少，變形菌門和擬桿菌門相對豐度隨著時間極顯著增加，而放線菌門相對豐度隨著時間顯著減少。該結果表明母豬乳汁菌群中優勢門的種類及豐度隨時間的變化與母豬的品種有關。

2.3.2 屬水平

表3表明，在母豬乳汁中相對豐度較高的前10個屬中，隨著時間的增加，大白豬乳汁中，叢毛單胞菌屬相對豐度極顯著增加，埃希氏-志賀氏菌屬相對豐度顯著增加，莫拉氏菌屬和擬桿菌屬相對豐度顯著減少，而其他菌屬豐度變化不顯著；皮特蘭豬乳汁中，埃希氏-志賀氏菌屬和叢毛單胞菌屬相對豐度極顯著增加，乳酸桿菌屬和鏈球菌屬相對豐度極顯著減少，羅姆布茨菌屬和嚴格梭菌屬相對豐度顯著減少。在兩品種豬乳中相對豐度隨時間顯著增加的優勢屬均具有埃希氏-志賀氏菌屬和叢毛單胞菌屬，而顯著減少的優勢屬各有不同。

表3 乳汁成熟度對微生物群落優勢屬相對豐度的影響

3 討論

本研究采用16S rDNA測序技術對大白豬和皮特蘭豬乳汁進行測序，通過OTU聚類分析、α多樣性分析和β多樣性分析發現，母豬初乳微生物豐富度和多樣性均高于成熟乳，且不同泌乳階段菌群結構差異較大，這可能與初乳中擁有更多的營養因子和生物活性物質有關，這些物質促進了初乳中微生物的生長發育。

通過對菌群組成進行分析，本研究發現，乳汁中細菌分屬68個門，其中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為母豬乳汁優勢菌門，這與Jiang[7]對牦牛乳的研究結果基本一致。豬品種和泌乳階段顯著影響乳汁中優勢菌群相對豐度的變化。Drago[8]等通過構建微生物網絡證明乳汁中的微生物群處于動態發展中，這與本研究結果一致，而不同品種母豬飲食的差異等因素可導致這種影響的發生。

大量研究表明母乳中存在潛在致病菌，其對仔豬健康產生深遠影響。仔豬體內右旋天冬氨酸會增加埃希氏-志賀氏菌屬豐度而誘發腸道炎癥[9]。Lopez-Serrano等[10]從仔豬體內分離出具有致病性的莫拉氏菌株，該菌株可導致仔豬呼吸道疾病的發生[11]。此外，鏈球菌屬也可致仔豬發生呼吸道疾病[12]。近年來研究發現擬桿菌可引起斷奶期仔豬腹瀉的發生[13]。本研究雖通過高通量測序以及查閱相關文獻在母豬乳汁中發現部分致病菌，但對于其在仔豬疾病和健康中的影響還需做進一步評估。