基于16S rDNA擴(kuò)增子測序技術(shù)分析豬乳汁中微生物菌落多樣性

劉 麗，聶曉彤，黃 迪，劉兆敏，李 夢

（德州學(xué)院生物物理研究院，山東 德州 253023）

作為我國農(nóng)業(yè)和國民經(jīng)濟(jì)的重要基礎(chǔ)，生豬養(yǎng)殖一直受到廣泛關(guān)注。目前針對仔豬已展開大量研究，但主要集中于斷奶后仔豬營養(yǎng)、疾病預(yù)防等方面，對哺乳期仔豬的研究相對較少[1]。哺乳期是仔豬生長發(fā)育最快、最易患病死亡的時期[2]，對該階段進(jìn)行研究可為生豬養(yǎng)殖提供理論指導(dǎo)。

乳汁是哺乳期仔豬的主要食物，其成分對仔豬的生長發(fā)育具有重要影響。目前對乳汁的報(bào)道主要集中在乳鐵蛋白、免疫蛋白和脂肪酸等生物活性物質(zhì)[3]，但此外，乳汁中還含有豐富的微生物[4]。已證實(shí)，母仔之間可通過母乳途徑進(jìn)行微生物垂直傳遞[5]，這些微生物構(gòu)成子代腸道微生物的先鋒菌群，在一定程度上決定了子代腸道菌群的形成與發(fā)展[6]。因此，本研究以養(yǎng)殖場常見豬種大白豬和皮特蘭豬為模型，通過高通量測序研究豬乳不同泌乳階段乳汁微生物的變化，為進(jìn)一步研究仔豬飼料中的益生菌添加提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇山東省新希望六和農(nóng)牧公司兩品種（大白、皮特蘭）具有相似預(yù)產(chǎn)期的健康母豬各8只，于妊娠第113天的上午9:00肌內(nèi)注射氯前列醇（每頭母豬0.2 mg）確保同步生產(chǎn)。分別在第0天（分娩當(dāng)天）和第7天收集每頭母豬乳汁，按照大白豬初乳、大白豬成熟乳、皮特蘭豬初乳、皮特蘭豬成熟乳分為4組，依次編號為：YC、YM、PC、PM，置于液氮中隨后儲存于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 乳汁樣本總DNA提取每個樣本各取800 μl加入1.5 ml離心管中，于12 000 g離心機(jī)離心10 min，棄上清液。使用Easy Pure? Micro Genomic DNA Kit DNA提取試劑盒提取總DNA，采用1 % 瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.2.2 PCR反應(yīng)和高通量測序委托上海美吉生 物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)及上機(jī)測序。測序引物為515F：5'-GTGCCAGCMGCCGC GGTAA-3'和806R：5'-GGACTACHVGGGTWTC TAAT-3'，測序區(qū)域?yàn)閂4區(qū)，測序平臺是Illumina MiSeq。

1.2.3 生物信息學(xué)分析通過Usearch 11進(jìn)行97 % OTU聚類，并生成特征表，與Silva數(shù)據(jù)庫比對，得到注釋結(jié)果，利用Mothur軟件和Qime軟件分別進(jìn)行菌群α多樣性和β多樣性分析。

2 結(jié)果

2.1 乳汁微生物樣本測序及聚類分析結(jié)果

利用16S rDNA測序技術(shù)對樣本進(jìn)行序列測定，獲得2390391條高通量序列，長度在221 bp～260 bp之間。OTU聚類結(jié)果表明，所測數(shù)據(jù)片段可以聚類成11 165個OTU，分布于68個門（phylum）、149個綱（class）、405個目（order）、783個科（family）、1 933個屬（genus）和4 329個種（species）（圖1）。

圖1 乳汁微生物運(yùn)算分類單元維恩分析圖

2.2 乳汁微生物樣本多樣性分析

采用t檢驗(yàn)計(jì)算乳汁微生物豐富度指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）。由表1可知，成熟乳微生物群落的Chao1和Shannon指數(shù)較初乳降低，說明隨著時間的增加，乳汁菌群多樣性和豐富度降低。PCoA主坐標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，成熟乳組與初乳組樣本離散程度較大，表明母豬不同泌乳階段乳汁菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

表1 樣本Alpha多樣性統(tǒng)計(jì)

圖2 各組乳汁微生物PCoA主坐標(biāo)分析圖

2.3 乳汁微生物組成分析

2.3.1 門水平

16S rDNA測序結(jié)果表明，母豬乳汁細(xì)菌群落在門水平上以厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門為主（表2）。與初乳相比，成熟乳中變形菌門豐度較高，而厚壁菌門和放線菌門豐度較低，擬桿菌門在大白豬乳汁中豐度較低，而在皮特蘭豬乳汁中豐度較高。上述結(jié)果表明母豬乳汁菌群中優(yōu)勢門的種類及豐度隨時間的變化而呈現(xiàn)不同程度的變化。

表2 乳汁成熟度對微生物群落優(yōu)勢門相對豐度的影響

在大白母豬不同泌乳階段，變形菌門相對豐度隨著時間變化而顯著增加（P＜0.05，下同），其他菌門變化不顯著；在皮特蘭母豬不同泌乳階段，厚壁菌門相對豐度隨著時間極顯著減少，變形菌門和擬桿菌門相對豐度隨著時間極顯著增加，而放線菌門相對豐度隨著時間顯著減少。該結(jié)果表明母豬乳汁菌群中優(yōu)勢門的種類及豐度隨時間的變化與母豬的品種有關(guān)。

2.3.2 屬水平

表3表明，在母豬乳汁中相對豐度較高的前10個屬中，隨著時間的增加，大白豬乳汁中，叢毛單胞菌屬相對豐度極顯著增加，埃希氏-志賀氏菌屬相對豐度顯著增加，莫拉氏菌屬和擬桿菌屬相對豐度顯著減少，而其他菌屬豐度變化不顯著；皮特蘭豬乳汁中，埃希氏-志賀氏菌屬和叢毛單胞菌屬相對豐度極顯著增加，乳酸桿菌屬和鏈球菌屬相對豐度極顯著減少，羅姆布茨菌屬和嚴(yán)格梭菌屬相對豐度顯著減少。在兩品種豬乳中相對豐度隨時間顯著增加的優(yōu)勢屬均具有埃希氏-志賀氏菌屬和叢毛單胞菌屬，而顯著減少的優(yōu)勢屬各有不同。

表3 乳汁成熟度對微生物群落優(yōu)勢屬相對豐度的影響

3 討論

本研究采用16S rDNA測序技術(shù)對大白豬和皮特蘭豬乳汁進(jìn)行測序，通過OTU聚類分析、α多樣性分析和β多樣性分析發(fā)現(xiàn)，母豬初乳微生物豐富度和多樣性均高于成熟乳，且不同泌乳階段菌群結(jié)構(gòu)差異較大，這可能與初乳中擁有更多的營養(yǎng)因子和生物活性物質(zhì)有關(guān)，這些物質(zhì)促進(jìn)了初乳中微生物的生長發(fā)育。

通過對菌群組成進(jìn)行分析，本研究發(fā)現(xiàn)，乳汁中細(xì)菌分屬68個門，其中厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門為母豬乳汁優(yōu)勢菌門，這與Jiang[7]對牦牛乳的研究結(jié)果基本一致。豬品種和泌乳階段顯著影響乳汁中優(yōu)勢菌群相對豐度的變化。Drago[8]等通過構(gòu)建微生物網(wǎng)絡(luò)證明乳汁中的微生物群處于動態(tài)發(fā)展中，這與本研究結(jié)果一致，而不同品種母豬飲食的差異等因素可導(dǎo)致這種影響的發(fā)生。

大量研究表明母乳中存在潛在致病菌，其對仔豬健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。仔豬體內(nèi)右旋天冬氨酸會增加埃希氏-志賀氏菌屬豐度而誘發(fā)腸道炎癥[9]。Lopez-Serrano等[10]從仔豬體內(nèi)分離出具有致病性的莫拉氏菌株，該菌株可導(dǎo)致仔豬呼吸道疾病的發(fā)生[11]。此外，鏈球菌屬也可致仔豬發(fā)生呼吸道疾病[12]。近年來研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌可引起斷奶期仔豬腹瀉的發(fā)生[13]。本研究雖通過高通量測序以及查閱相關(guān)文獻(xiàn)在母豬乳汁中發(fā)現(xiàn)部分致病菌，但對于其在仔豬疾病和健康中的影響還需做進(jìn)一步評估。