鹽酸氨溴索注射液微生物限度方法學驗證

吳駿鑫　藍陳陳　于琦

摘要：目的：建立鹽酸氨溴索注射液微生物限度檢查方法。方法依據《中國藥典》2020版四部1105非無菌產品微生物限度檢查法：微生物計數法進行方法適用性驗證。結果：采用薄膜過濾法，使用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗量為每膜400ml，適用性試驗中各試驗菌株的回收率比值均在0.5～2.0范圍內，符合實驗要求。結論該方法可適用于鹽酸氨溴索注射液微生物限度的檢查。

關鍵詞：鹽酸氨溴索注射液;微生物限度;薄膜過濾法

中圖分類號：R917?? 文獻標識碼：A? 文章編號：

Abstract：Objective：To establish a microbial limit test method for Ambroxol Hydrochloride Injection. Methods? according to China Pharmacopoeia 2020 edition four 1105non microbial products microbial limit test： microbial counting method applicability validation. Results? The membrane filtration method is adopted， and usepH7. 0 sterile Sodium Chloride Peptone buffer， the flushing volume is 400ml per membrane， and the recovery ratio of each test strain in the applicability test is in the range of 0.5 ～ 2.0， which meets the experimental requirements. Conclusion? T The method can be used to check the microbial limit of ambroxol hydrochloride injection.

Key words： Ambroxol Hydrochloride Injection.;microbial limit test; membrane filtration method

鹽酸氨溴索是一種有機化合物，可促進呼吸道內部粘稠分泌物的排除及減少粘液的滯留，因而顯著促進排痰。適用于伴有痰液分泌不正常及排痰功能不良的急性、慢性呼吸系統疾病，例如：慢性支氣管炎急性加重，喘息型支氣管炎、支氣管哮喘的祛痰治療;術后肺部并發癥的預發性治療;早產兒及新生兒嬰兒呼吸窘迫綜合癥（ARDS）的治療。

1 儀器與材料

classⅡType A/B3型生物安全柜（美國法瑪西亞公司）;XG.1DTE-0.6型脈動真空滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）;LMQ.C-50E型立式滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司）;KB115E3.1型低溫生化培養箱（BINDER）;LRH-325A型生化培養箱（廣東宏泰君科學儀器股份有限公司）;HTY-601型集菌儀（浙江泰林生物技術股份有限公司）。

xxxx-xx-xx

基金項目名稱（編號）

姓名（出生年—），性別，籍貫，學位，職稱，研究方向.（必須提供第一作者信息）

試藥

鹽酸氨溴索注射液（杭州澳亞生物技術股份有限公司，批號為201G0242，201G0243，201G0244）。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均來自浙江食品藥品檢定研究院，工作菌株為第五代。

胰酪大豆胨瓊脂培養基（江蘇益瑪生物科技有限公司，批號201023-1），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（自制;批號為201112）;pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（青島高科技工業園海博生物技術有限公司，批號為20201029），0.9%氯化鈉注射液（山東齊都藥業有限公司;批號為1910282162），聚山梨酯80（國藥集團化學試劑有限公司，批號為20190919），上述培養基適用性檢查結果均符合2020年版《中國藥典》要求。

2方法與結果

2.1菌液制備

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物接種至胰酪大豆胨瓊脂培養基上或胰酪大豆胨液體培養基中，30℃～35℃培養18～24小時。取白色念珠菌的新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖液體培養基中，20℃～25℃培養2～3天。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升不大于100cfu的菌懸液。

將黑曲霉的新鮮培養物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養基上，20℃～25℃培養5～7天使大量孢子成熟，加3～5ml含0.05%（v/v）聚山梨酯80的 0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（v/v）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每毫升不大于100cfu的孢子懸液。

2.2菌液計數

取金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉各不大于100cfu，接種至胰酪大豆胨瓊脂培養基上，每株試驗菌平行接種兩個平皿。銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌置30～35℃培養，培養時間不超過3天，計數;白色念珠菌、黑曲霉置30～35℃培養，培養時間不超過5天，計數。取白色念珠菌、黑曲霉各不大于100cfu，接種至沙氏葡萄糖瓊脂培養基上，每株試驗菌平行接種兩個平皿，置20～25℃培養，培養時間不超過5天，計數。結果如下。不同菌種在對應的稀釋濃度下，菌落計數均符合規定。

2.3微生物計數方法適用性試驗

試驗組：取鹽酸氨溴索注射液供試液3批每批各7份，每份100ml，加入試驗菌液（白色念珠菌、黑曲霉各制備兩份，其余試驗菌各一份），混勻。每份分別通過裝有0.45μm孔徑濾膜的集菌器過濾，使每張濾膜所濾過的供試液中含菌量不大于100cfu，經過每張濾膜的供試品量為100ml。然后每張膜用400ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，過濾。金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿上;白色念珠菌、黑曲霉分別取一份貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿上，另一份貼于沙氏葡萄糖瓊脂平皿上。

供試品對照組：取鹽酸氨溴索注射液供試液2份，每份100ml，分別通過裝有0.45μm孔徑濾膜的集菌器過濾，然后每張膜用400ml的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗，過濾，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿和沙氏葡萄糖瓊脂平皿上。

菌液對照組：以稀釋液代替供試液，按試驗組操作加入試驗菌。

陰性對照組：取試驗用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液2份，每份100ml，分別通過裝有0.45μm孔徑濾膜的集菌器過濾，分別貼于胰酪大豆胨瓊脂平皿和沙氏葡萄糖瓊脂平皿上。

將TSA平板置培養箱，33.0℃下培養，加有金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的培養3天，加有白色念珠菌、黑曲霉的培養5天，計數結果見表2、表3和表4。

將SDA平板置培養箱，21.5℃下培養5天，計數結果見表5、表6和表7。

由表2至表7可知，試驗組的菌回收率均在0.5～2范圍內，且陰性對照組無菌生長，即說明供試品的微生物計數的方法適用性試驗通過。

3 討論

根據《中國藥典》2020年版四部1105非無菌產品微生物限度檢查法，微生物限度檢查法可采用平皿法、薄膜過濾法、MPN法。鹽酸氨溴索是一種有機化合物能溶于水，且無特殊抑菌性，故采用薄膜過濾法進行微生物限度檢查。經驗證結果顯示，3批供試品組及菌液對照組在使用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗400ml每膜后，回收率在合格范圍內符合規定。故鹽酸氨溴索注射液可以采用上述驗證方法，結果可行且可靠。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（四部）.北京：中國醫藥科技出版社，2020：160-165.

[2]張彩萍.鹽酸氨溴索藥理機制、臨床應用及不良反應現狀的概述[J].心理醫生，2018，29（4）：106-106.

[3]鄭滑，翟留群，付海爾等.注射用鹽酸氨溴索在兒科的臨床應用分析[J].中國現代醫藥雜志，2019，21（7）：92-95..

[4]李金萍，雷敏剛.鹽酸氨溴索注射液對急性呼吸窘迫綜合征新生兒血漿ET-1水平的影響.[J].檢驗醫學與臨床，2017，14（17）：2625-2626.

[5]孫愛琴.基層微生物實驗室標準菌株的制備和保存方法[J]《醫學動物防制》，2015，31（8）：942-942

[6]馬仕洪，劉鵬，楊利洪等.藥品微生物限度檢查方法適用性試驗中加菌方式的實驗研究[J].藥物分析雜志，2018，38（5）：877-882.

[7]余為.薄膜過濾法在藥品檢驗中的應用探討[J]世界最新醫學信息文摘，2019，19（60）262-262

[8]韓顏，陳泊穎，蘇娜等.鹽酸氨溴索平衡溶解度和表觀油水分配系數的測定[J].藥物評價研究，2016，39（4）：615-618.