TLR與PI3K-Akt通路交互調控的研究進展

尹秀娟，涂怡，劉昱

（武漢大學 生命科學學院，湖北武漢 430072）

TLR是天然免疫的重要防御分子，作為病原模式識別受體定位在細胞膜或內體膜上。TLR家族能識別包括病毒、細菌、寄生蟲和真菌在內的多種微生物攜帶的病原相關分子，啟動抗感染炎癥和干擾素反應。定位在細胞膜上的TLR主要識別病原體細胞表面組分，如TLR4識別細菌壁上的脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），TLR5識別細菌鞭毛蛋白；定位在內體的TLR主要識別各類核酸，如TLR3負責識別雙鏈RNA，TLR9識別2’-脫氧胞嘧啶-磷酸-鳥嘌呤DNA。大量的實驗研究表明，TLR在抗感染免疫中發揮重要作用。例如，TLR4敲除小鼠對傷寒沙門氏菌的免疫力顯著降低，感染后死亡率增加[1-2]；TLR2敲除小鼠在感染金黃色葡萄球菌后的存活率顯著降低[3]；與野生小鼠相比，TLR3或TLR9缺陷小鼠抗病毒能力顯著下降，自然殺傷細胞的活化也顯著降低[4]。

所有的TLR都是I型跨膜蛋白，具有相似的結構組成：N端胞外段的多個亮氨酸富集（Leucine-Rich Repeats，LRR）結構域、中間跨膜結構域和C端胞質側的Toll-白介素受體（Toll/Interleukin-1 Receptor，TIR）同源結構域。TLR通過胞外段LRR結構域識別配體，胞質側TIR結構域募集下游接頭蛋白髓樣分化因子（Myeloid Differentiation Factor 88，MyD88）或β干擾素TIR結構域銜接蛋白（TIR Domain-Containing Adaptor-Inducing Interferon-β，TRIF），激活信號轉導的級聯反應，進而活化轉錄因子——核因子κB（Nuclear Factor-κB，NF-κB）和干擾素調節因子（Interferon Regulatory Factor，IRF），啟動炎癥因子和干擾素的轉錄。

適時適度的免疫反應對于病原體清除和維持內環境穩態十分重要，長時或超強的炎癥反應對正常細胞和組織會造成傷害，甚至威脅到生命安全。如TLR通路過度活化會引起I型糖尿病、類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡、多發性硬化癥等各種自身免疫病的發生[5-7]。因此，TLR通路的精細調控機制一直是領域內的關注點之一。細胞內存在多種負調控機制抑制TLR通路過度活化，例如巨噬細胞能夠通過下調細胞表面TLR4的表達抑制NF-κB的活化，從而降低細胞對脂多糖（Lipopolysaccha ride，LPS）的反應性[8]；白細胞介素受體相關激酶-M（IL-1 Receptor Associated Kinase，IRAK-M） 通 過 阻 止IRAK1和IRAK-4與MyD88解離，并限制活化的IRAK1與腫瘤壞死因子受體相關蛋白6（Tumor Necrosis Factor-Associated Factor 6，TRAF6）形成復合體，抑制TLR2、TLR3、TLR4和TLR9信號通路活化[9]；去泛素化酶A20通過其保守的OTU樣結構域切割TRAF6上的K63連接的泛素鏈，進而抑制NF-κB的活化[10]。

此外，細胞內多條信號通路之間存在密集的交互調控，如PI3K-Akt信號通路活化可以負調控TLR免疫反應。值得注意的是，在基因敲除技術應用之前，PI3K-Akt通路在TLR信號中的作用均采用PI3K通路的抑制劑開展研究，但結果存在爭議。一些研究認為PI3K促進NF-κB的活化，從而促進炎癥反應，如ARBIBE等[11]報道TLR2-Rac1-PI3K-Akt組成的級聯信號反應能夠以不依賴于IκB降解的方式促進p65的反式激活，從而促進p65調控的炎癥因子的轉錄。而另一些研究則表明PI3K抑制炎癥反應，如NOUBIR等[12]表明，PI3K通過促進IRAK的降解抑制NF-κB的活化。當基因敲除技術用于敲除小鼠p85基因后，一系列實驗均表明PI3K-Akt通路在TLR介導的免疫反應中發揮重要的負調控作用[13]。不同于其他負反饋調節機制，PI3K-Akt通路在TLR信號早期就開始發揮作用。但PI3K是如何在TLR刺激物的誘導下被招募到TLR復合體上以及是如何被活化的？這些問題一直沒有確切的答案。本文對近年來TLR和PI3K-Akt兩條通路交互調控的文獻進行綜述，以期增進對TLR通路調控機制的理解。

1 PI3K-Akt信號通路概述

1.1 PI3K

PI3K是一類以磷脂酰肌醇為底物的絲氨酸-蘇氨酸激酶，能夠將膜脂上的磷脂酰肌醇（Phosphatidylinositol，PI）、磷脂酰肌醇4磷酸（PI4P）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PI(4,5)P2）上的肌醇環上第三位羥基磷酸化，分別形成磷脂酰肌醇3磷酸（PI3P）、磷脂酰肌醇-3,4-二磷酸（PI(3,4)P2）和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PI(3,4,5)P3或PIP3）。根據PI3K催化底物的不同以及催化亞基的序列同源性，可將PI3K家族分為I型、Ⅱ型和Ⅲ型。

I型PI3K是由一個催化亞基和一個調節亞基組成的異源二聚體，通過結合細胞膜上酪氨酸激酶相關受體或受體底物上磷酸化的酪氨酸殘基，招募到質膜上活化，催化底物PI(4,5)P2產生大量的PIP3，PIP3作為第二信使將信號向下傳遞。根據亞基類型的不同，I型PI3K又可細分為A類和B類兩個亞型。

IA型PI3K的催化亞基包括p110α、p110β和p110δ；調節亞基包括p85α、p85β、p55α、p55γ和p50α。催化亞基p110α和p110β幾乎在所有的組織中都有表達，而p110δ主要表達在白細胞中。所有的調節亞基都包含3個SH2結構域，其中兩個能夠結合信號蛋白上的磷酸化酪氨酸殘基，另一個結合p110。p85是最主要的調節亞基，可以雙向調節p110的功能。在靜息狀態下，p85與p110結合，掩蓋p110催化活性位點，抑制其催化活性，并使p110在胞漿內不被降解；當上游底物分子的酪氨酸殘基磷酸化時，p85通過自身SH2結構域結合底物分子，并將p110帶到質膜上，暴露p110催化活性位點，活化后的p110催化底物產生大量的PIP3[14]。

IB型PI3K的催化亞基只有p110γ一種，調節亞基為p101和p87。IB型PI3K的催化亞基p110γ與IA型PI3K催化亞基具有相似的結構與功能，但其N端沒有p85結合結構域，而是含有一個功能不確定的PH結構域。具有廣泛作用的G蛋白偶聯受體（G Protein-Coupled Receptors，GPCR）介導了經典的IB型PI3K活化。GPCR與配體結合活化后促使與之結合的G蛋白α亞基解離；而G蛋白β亞基和γ亞基結合PI3K（p110γ/p101）異二聚體，并激活p110γ的激酶活性，p110γ被活化后催化底物PI(3,4)P2產生大量的第二信使PIP3[15]。

Ⅱ型PI3K分為3個亞型，分別為PI3KC2α、PI3KC2β和PI3KC2γ。其中，PI3KC2α主要定位于高爾基體反面網格結構和網格蛋白包被的囊泡中，PI3KC2β主要定位在胞內低密度的微粒體組分中。在體外，Ⅱ型PI3K優先選擇的底物是PI和PI4P。與I型PI3K的活化方式不同，Ⅱ型PI3K通過C端的C2結構域結合Ca2+-ATP來激活自身的磷脂激酶活性。目前為止，Ⅱ型PI3K在胞內的功能及具體參與調控的信號通路仍不清楚。

Ⅲ型PI3K由催化亞基Vps34和調節亞基Vps15組成。Vps15本身是一個絲氨酸-蘇氨酸激酶，對Vps34的穩定性、活性和膜靶向性有重要的調控作用。Vps34/Vps15催化底物PI產生的PI3P是胞內PI3P的主要來源。第二信使PI3P通過招募具有FYVE或PX結構域的接頭蛋白將信號向胞內傳遞[16]。Vps34/Vps15主要負責調控膜轉運過程，在內體蛋白分選、內體-溶酶體成熟、自噬體形成中發揮核心作用[17-18]。

1.2 Akt

Akt是PI3K-Akt信號轉導的核心節點。作為絲氨酸-蘇氨酸激酶，Akt激活后參與調控細胞生長、增殖、存活、代謝和遷移等多種生理過程。Akt由N端的PH結構域、中間的催化結構域和C端的疏水基序（Hydrophobic Motif，HM）組成。Akt通過PH結構域結合膜上由PI3K催化生成的PIP3。轉位到質膜的Akt被同樣招募到質膜上的3磷酸肌醇依賴性激 酶 1（3-Phosphoinositide Dependent Protein Kinase 1，PDK1）和雷帕霉素靶蛋白復合體2（Mammalian Target of Rapamycin Complex 2，mTORC2）共同催化而活化。其中，PDK1催化Akt的Thr308發生磷酸化，而mTORC2催化Akt的Ser473發生磷酸化[19]。這兩個位點的磷酸化過程獨立發生，但只在Thr308發生磷酸化的Akt激酶活性較低[20]。

活化的Akt參與多條信號通路的調控。在核內，Akt通過磷酸化轉錄因子—叉頭盒蛋白O1（Forkhead Box Protein O1，FoxO1）的T24、S256和S319位點，促使FoxO1從細胞核轉位到胞質，從而抑制FoxO1介導的細胞凋亡基因、周期調控和代謝相關基因的轉錄[21]。在細胞質中，Akt通過磷酸化糖原合酶激酶3（Glycogen Synthase Kinase 3，GSK3）的 S9和 S21位點，抑制GSK3的激酶活性，失活的GSK3無法調控細胞凋亡和糖原合成等生理過程[22]。Akt還可以通過磷酸化結節性硬化癥蛋白2（Tuberous Sclerosis Complex 2，TSC2），解除TSC復合體對mTORC1的抑制[23]；活化的mTORC1可以進一步磷酸化核糖體蛋白S6激酶（Ribosomal Protein S6 Kinases，RPS6Ks或S6K）和真核轉錄抑制因子4E結合蛋白（Eukaryotic Translation Initiation Factor 4E Binding Proteins，eIF4EBPs或4EBP1）。而活化的S6K通過磷酸化靶蛋白S6促進糖酵解及蛋白質、脂質和核苷酸的合成；活化的4EBP1解除了對真核轉錄抑制因子的抑制，從而促進細胞周期和存活相關基因的轉錄。

2 TLR通路與PI3K-Akt通路之間的交互調控

多種TLR刺激物在活化TLR通路的同時，也能夠激活PI3K-Akt信號通路。例如，在293-TLR2和THP1細胞中，金黃色葡萄球菌誘導TLR2和Rac1的活化及TLR2-Rac1-P85復合體的形成，被招募到TLR2復合體的PI3K活化，進一步促進Akt的激活[11]。TLR2和TLR4激動劑處理小鼠Raw264.7細胞時，不加PI3K抑制劑的對照組能夠檢測到明顯的Akt磷酸化，而PI3K抑制劑預處理的實驗組幾乎檢測不到[24]。在過表達野生型TLR5的HeLa細胞中，TLR5激動劑能夠顯著誘導Akt的磷酸化；過表達突變型TLR5的HeLa細胞中，TLR5激動劑則無法誘導Akt的活化。PI3K抑制劑能夠阻斷TLR5激動劑誘導的Akt的磷酸化，表明TLR5激動劑能夠以TLR5依賴的途徑誘導PI3K-Akt的活化[25]。

盡管有一些研究認為PI3K的活化能夠促進TLR通路介導的炎癥反應，如PI3K-Akt信號能夠明顯促進TLR4介導的NF-κB的反式激活[26]，但基于基因敲除的實驗研究表明PI3K的活化抑制TLR介導的下游轉錄因子的活化以及炎癥因子的產生[13,27-28]。采用LPS刺激PI3K敲除或PI3K抑制劑處理的小鼠樹突狀細胞，發現由TLR4介導的炎癥因子IL-12產生顯著增加，抗炎因子IL-10的產生顯著減少[13]。在人類單核細胞中，PI3K-Akt通路的活化抑制LPS誘導的腫瘤壞死因子和組織因子的產生[29]。PI3K-Akt下游mTOR、GSK3β FoxO1均參與抑制TLR介導的炎癥反應。（1）mTOR能夠通過促進IL-10的轉錄抑制LPS誘導的炎癥因子的產生，而PI3K抑制劑或雷帕霉素能夠顯著抑制mTOR的作用。（2）Akt通過磷酸化GSK3β抑制其活性，而失活的GSK3β通過增強轉錄因子CREB在S133位點的磷酸化及其與共激活因子CBP的結合力抑制p65與CBP的結合，從而抑制p65調控的炎癥因子的轉錄[30]。（3）轉錄因子FoxO1通過結合TLR4基因上多種增強子樣元件促進TLR4基因的轉錄，進而促進TLR4介導的炎癥反應；但活化的Akt通過磷酸化FoxO1介導FoxO1的失活和出核，從而抑制TLR4轉錄[31]。

PI3K在TLR通路的哪個環節發生活化及其活化的具體機制還在不斷探索中。已有多個參與調控TLR-PI3K-Akt通路的分子被報道，現簡單介紹如下。

2.1 BCAP

B細胞銜接蛋白（B Cell Adaptor for Phosphoinositide 3-Kinase，BCAP）作為B細胞傳遞PI3K信號的接頭蛋白而被命名，在巨噬細胞中高表達。NI等[32]發現，抑制小鼠骨髓來源的巨噬細胞中BCAP的表達，可顯著增加TLR4、TLR7和TLR9介導的炎癥因子產生，而PI3K和Akt的磷酸化則被顯著抑制。通過免疫共沉淀實驗，他們發現BCAP和PI3K的p85亞基具有持續性相互作用：靜息狀態下BCAP通過富脯氨酸區域與PI3K調節亞基p85的SH3結構域結合，形成一個無活性的復合體；LPS刺激后BCAP在膜組分中的蛋白量及磷酸化水平顯著增加，隨后又回到靜息水平，表明TLR4活化后招募BCAP到質膜上[32]。隨后，TROUTMAN等[33]的研究結果表明，BCAP通過N端的TIR結構域與MyD88和Toll/白細胞介素-1受體結構域銜接蛋白（TIR-Domain Containing Adaptor Protein，TIRAP）相互作用。在胞內，BCAP YXXM位點的酪氨酸殘基能夠被脾酪氨酸激酶（Spleen Tyrosine Kinase，Syk）在內的多種激酶磷酸化，為p85提供結合位點，磷酸化殘基與p85的N端和C端的兩個SH2結構域先后結合，從而使PI3K完全活化[34]。BCAP通過促進PI3K-Akt通路的活化調控巨噬細胞代謝重排和組蛋白的乳酸化修飾，進而促進炎癥性巨噬細胞M1向修復型巨噬細胞M2轉變。在BCAP缺失的情況下，PI3K-Akt通路無法活化，使細胞的有氧糖酵解減少，進一步抑制乳酸生成和組蛋白的乳酸化修飾，最終導致巨噬細胞的組織修復相關基因的表達受到抑制而無法向M2型轉變[35]。

2.2 Rab8a和LRP1

Rab8a蛋白是具有三磷酸鳥苷（Guanosine Triphosphate，GTP）酶活性的Rab家族成員，參與細胞質膜運輸，影響細胞形態和細胞極化，也能抑制多個TLR介導的炎癥反應[36-37]。LPS可誘導Rab8a和Akt在細胞膜上的含量明顯增多；敲低Rab8a顯著抑制LPS誘導的Akt磷酸化，進而促進IL-6和IL-12轉錄，抑制IL-10轉錄。除了LPS，TLR3和TLR9激動劑也能夠活化Rab8a及下游Akt。體內外蛋白結合實驗顯示，Rab8a與PI3K的p110γ亞基存在直接的相互作用，表明Rab8a在TLR4信號通路和PI3K-Akt信號通路間發揮橋梁作用。

Rab8a如何介導兩條通路間的相互交流，有多種不同的解釋。LUO等[37]的研究表明，活化的TLR4招 募MyD88樣 銜 接 蛋 白（MyD88-Adapter-Like，Mal）到細胞膜上，而Mal與Rab8a在細胞膜上存在共定位，提示Mal可能介導Rab8a-PI3K-Akt通路的活化。進一步研究表明，Rab8a并非直接被招募到TLR4復合體，而是由具有酪氨酸激酶活性的低密度脂蛋白受體相關蛋白1（Low-Density Lipoprotein-Receptor-Related Protein 1，LRP1）介導[38]。在 TLR4缺失的小鼠骨髓源巨噬細胞中，LPS無法誘導LRP1發生Y4507（主要位點）和Y4474位點的磷酸化活化；但在Mal或TRIF缺失的巨噬細胞中，LPS仍可誘導LRP1活化，提示LRP1活化與TLR4直接相關。GST pull-down實驗表明，只有活化的LRP1與Rab8a存在相互作用，Y4507和Y4474雙位點失活突變的LRP1幾乎不存在與Rab8a的相互作用。敲除LRP1明顯抑制LPS誘導的Rab8a和Akt-mTOR的活化，提示LRP1位于Rab-PI3K-Akt通路的上游[38]。和Rab8a一樣，多種TLR活化可以激活跨膜蛋白LRP1。此外，Rab3A的鳥嘌呤核苷酸交換因子(Guanine Nucleotide Exchange Factor for Rab3A，GRAB)和Rabin8都是已知的Rab8a的鳥苷酸交換因子，能夠使Rab8a釋放二磷酸鳥苷（Guanosine Diphosphate，GDP）并結合GTP。在巨噬細胞中，同時敲除GRAB和Rabin8明顯抑制LPS誘導的Akt磷酸化，且招募到細胞膜上的Akt也明顯減少，提示Rab8a需要自身GTP酶活性才能介導TLR活化PI3K-Akt通路[39]。

2.3 Tim3

Tim3是在T細胞、樹突狀細胞和巨噬細胞中表達的跨膜蛋白，能夠直接調節T細胞反應，抑制TLR4介導的炎癥反應[40-41]。Tim3能夠通過抑制TLR4介導的炎癥反應顯著降低膿血癥的致死率。在Raw264.7細胞中，活化的Tim3能夠顯著抑制LPS誘導的NF-κB抑制蛋白α（inhibitor of NF-κB α，IκBα）降解，而敲低Tim3可抑制LPS誘導的Akt磷酸化，促進IκBα的降解[42]。這表明，Tim3可能通過促進Akt的活化來抑制NF-κB的活化。在漿細胞樣樹突狀細胞中，Tim3與p85和干擾素調節因 7（Interferon Regulatory Factor 7，IRF7） 在 溶 酶體中存在共定位，提示Tim3可能與p85或IRF7的降解有關。考慮到Tim3的表達具有細胞特異性，所以Tim3在TLR-PI3K通路交流中的作用可能不具有細胞共性[43]。

2.4 JAK3

Janus激酶(Janus Kinase，JAK)是一類重要的酪氨酸激酶。采用JAK3抑制劑處理人單核細胞，能夠顯著促進TLR2、TLR4或TLR5配體誘導的IL-12和腫瘤壞死因子的產生，而抑制IL-10的產生；與此同時，Akt、mTORC1和GSK3β的磷酸化水平也顯著降低[44-45]。在LPS刺激下，PI3K抑制劑和JAK3抑制劑的聯合運用更加顯著地促進JAK3抑制劑對IL-12和IL-10表達的調控作用；而GSK3β的敲低或抑制劑的處理能夠抵抗JAK3抑制劑的調控作用。JAK3抑制劑的使用能夠明顯促進LPS誘導的p65 S536位點的磷酸化及其DNA結合活性。使用GSK3能夠逆轉JAK3抑制劑對p65的作用。這表明，JAK3能夠通過促進PI3K-Akt-GSK3β信號通路的活化抑制TLR4介導的NF-κB的激活及下游炎癥因子的產生。

3 結語

TLR在天然免疫反應中發揮不可或缺的作用，但是過度的TLR通路活化會對正常組織器官造成傷害。PI3K-Akt通路參與了細胞多種生理活動的信號傳遞，對TLR通路的活化發揮有效的限制作用。本文對參與TLR通路與PI3K通路交互調控的分子及其機制進行總結，以TLR4-PI3K-Akt活化為例，大致可歸納為如下的機制（圖1）：（1）在LPS誘導下，活化的TLR4通過接頭蛋白MyD88和TIRAP招募BCAP，促使BCAP發生YXXM位點上酪氨酸的磷酸化；（2）PI3K的調節亞基p85結合BCAP磷酸化的酪氨酸殘基；（3）活化的TLR4通過LRP1招募Rab8a及p110γ/p101到質膜上并使PI3K活化，但p110γ如何被活化尚不清楚，而p85與p110之間的相互作用可能參與其中；（4）PI3K的產物PIP3招募并促進Akt的激活；（5）活化的Akt可以通過促進mTOR活化、磷酸化失活FoxO1和GSK3β抑制TLR4介導的炎癥因子產生。

圖1 PI3K-Akt信號通路抑制TLR介導的炎癥因子的產生

本文對TLR信號通路和PI3K-Akt信號通路之間的交互調控機制進行了綜述，有助于進一步完善TLR通路的精密調控網絡圖，并為深入探討PI3K-Akt通路活化引起的代謝變化對TLR介導的免疫反應的影響提供了豐富信息。