重金屬耐性微生物的分離篩選及耐性機制研究進展

盧譽之，閆婧宇，易汪兮月，李瑩瑩，盛紅坤

（南開大學濱海學院，天津 300270）

隨著工業化進程的加速，人類的工業活動，例如礦產開采、污染超標空氣持續排放、大量使用化肥和含重金屬材料，造成鉛、銅、鎘和鎳等毒性較大的重金屬元素及其合成物進入環境各圈層中。生長于重金屬污染環境中的動植物以及微生物不斷被迫吸收重金屬，隨著時間的推移和營養級在食物鏈中的升高，重金屬物質在食物鏈上層的生物體中的濃度也逐漸升高[1-4]。在修復重金屬污染過程中，最常用到的是微生物修復，其中植物根際微生物起到了很大的作用。微生物通過與重金屬絡合、吸附、氧化和還原等反應后，改變了重金屬在土壤中的移動方向以及存在形態，很大程度上降低了重金屬活性或毒性，起到修復土壤的作用。

1 微生物對重金屬元素的耐性機制

1.1 離子交換

重金屬離子在細胞外不能產生任何毒害作用，只有進入細胞后才能產生作用。大部分細胞對重金屬元素有兩種吸收系統：一種是快速的，不依賴單一底物運載，主要靠細胞內外離子濃度差進入細胞內；另一種是慢速的，以ATP水解產生的能量作為運載物，通常只有細胞急需時才使用[5]。XIONG等[6]通過對比酸性和堿性介質中硫酸交聯褐藻（CAS）吸附Re（Ⅶ）前后的傅里葉變換紅外光譜，提出離子交換是酸性條件中CAS吸附Re（Ⅶ）的主要原理作用。吳娟和李清彪[7]研究發現，在試驗開始前，Pb2+溶液中Ca2+、Mg2+的濃度為0 mg/L，反應后Ca2+和Mg2+的濃度分別變成0.13 mg/L和0.21 mg/L，說明黃孢原毛平革菌可利用離子交換的方式吸收Pb2+。

1.2 氧化還原

氧化還原作用是微生物處理重金屬元素過程中重要的解毒作用。勞昌玲等[8]將制革廢液中篩選出的蠟樣芽孢桿菌接種于含鉻溶液中，可以觀察到Cr6+濃度減少，Cr3+濃度增多，毒性明顯降低；游離態的Au毒性很強，是因為游離態Au極易與生物細胞內的谷胱甘肽結合，進而抑制相關酶的活性，單質Au卻對微生物基本沒有毒害作用；Au離子在不同的微生物細胞中反應機制各不相同，微生物可通過酶、分泌物等化學物質還原Au離子，起到解毒的作用。

1.3 重金屬積累與溶解

微生物對重金屬積累的作用方式有官能團吸附、細菌胞外復合物、鐵介質和金屬鹽類反應[9]。此外，富集作用與上述方法都有所不同，富集作用是細胞內發生的主動運輸過程，是重金屬離子從細胞外借助蛋白質載體，穿過細胞膜進入細胞質中的過程[10]。微生物對重金屬的溶解常見于各種代謝活動，在生長過程中，微生物會通過自主生理代謝產生很多有機物，這些有機物能與重金屬結合，使重金屬較易溶解[8]。1986年，PATTERSON和PASSINO提出細菌可以通過自身產出有機物質溶解重金屬或含重金屬的礦物質[11]。

1.4 酶促作用

依據微生物細胞的活性程度，可以分為非活性細胞和活性細胞，兩種都能夠吸附重金屬離子。其中，細胞上某些酶的活性很可能對活性生物細胞吸收金屬離子的能力有影響。如HOLAN等[12]研究活性啤酒酵母對Cd2+吸附情況時發現，鎘的磷酸鹽沉淀物在細胞的液泡中大量存在，因此認為在細胞培育過程中加入“磷酸供體”后所產生的磷酸酶，是Cd2+進入細胞時所需的酶。微生物吸附重金屬離子時所涉及到的酶促反應機理種類繁多，雖然很多專家致力于此領域，但至今還未有一個完整且詳細的理論體系可以說明該反應機理。

2 重金屬耐性微生物的分離篩選

2.1 耐鎘微生物的分離篩選

田振華[13]采用Cd2+濃度馴化法從鎘污染土壤中篩選出一株曲霉屬真菌，耐鎘濃度達20 mg/kg。徐婷婷[14]采用澆注平板法從錳礦附近的土壤中篩選出一株棘孢曲霉，耐鎘濃度為20 mg/L。李輝[15]采用劃線純化法從Pb、Cd污染的土壤中篩選出一些耐鎘的菌株，細菌有葡萄球菌屬、黃桿菌屬、摩根氏菌屬和檸檬酸菌屬等，真菌有根霉屬、鐮刀菌屬、釀酒酵母屬和頭孢霉屬等；所有菌株在含鎘濃度為250 mg/L的培養基上長勢較好。劉愛民[16]采用平板直接分離耐鎘細菌的方法，從鎘污染土壤表層中篩選得到一株假單胞菌，耐鎘濃度為40 mmol/L。

2.2 耐鉛微生物的分離篩選

張璐等[17]采用劃線純化法從尾礦區土壤中篩選出兩株菌株，G-1為芽孢桿菌屬，G-2為克雷伯菌，分別可以在Pb2+為2 000 mg/L的培養基中生長。闞洪媛等[18]采用濃度馴化法從某煤矸石土壤中篩選出一株蠟狀芽孢桿菌，其耐Pb2+質量濃度為800 mg/L。李輝等[15]使用劃線純化法從Pb、Cd污染的土壤中篩選出一些耐鉛菌株，鑒定為動性球菌屬、節桿菌屬、葡萄球菌屬等，真菌初步鑒定為根霉屬、鐮刀菌屬、青霉屬等。

2.3 耐鎳微生物的分離篩選

賈成光等[19]采用平板直接篩選法從二沉池污泥中分離出一株寡養單胞菌，是一株耐鎳濃度為400 mg/L的革蘭氏陰性菌。曲媛媛等[20]采用濃度梯度篩選法，從二沉池污泥中得到一株耐鎳100 mg/L的腸桿菌。蘭曉君等[21]采用稀釋涂布法從金川鎳礦中篩選出一些菌株，這些菌株分屬于4大類11個屬14個分類單元，其中38株屬于放線門，12株屬于厚壁菌門，3株屬于變形菌門α亞群，2株屬于變形菌門γ亞群；其中，最小抑制濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC）最高為 20 mmol/L。

2.4 耐鉻微生物的分離篩選

何元等[22]采用篩選、馴化法從鉻污染的環境中得到一株沙雷氏菌，可以在1 000 mg/L 含鉻培養基中正常生長。李靜等[23]采用劃線純化法從攀枝花礦區植物根際土中分離出一株鏈霉菌，可在Cr4+濃度達到1 000 mg/L時生存。李政紅等[24]通過耐鉻菌富集的方法，在某皮革廠垃圾堆、污灌渠底泥收集的富含鉻污染的土壤樣品中篩選出一株無色桿菌，pH5.5～8.5、30 ℃為其最佳生長環境。

2.5 耐銅微生物的分離篩選

魯陳等[25]采用涂布平板法從含銅土壤中篩選出兩株長勢較好的菌株——FT5和FT7，分別為青霉菌和黑曲霉菌，耐受濃度為1 000 mg/L。劉婷婷等[26]采用平板稀釋法從銅污染土壤中篩選出一株放線菌，耐銅濃度最大為8 000 mg/L。盧福芝等[27]采用涂布平板法從重金屬污染的土壤中篩選出一株根霉菌，耐銅濃度達到30 mmol/L。張小菲等[28]采用稀釋涂布法從含銅的土壤樣品中篩選出一株節桿菌，最大耐銅質量濃度為100 mg/L。

上述5種重金屬元素耐性微生物的分離篩選信息見表1。

表1 耐重金屬微生物的篩選

3 影響微生物修復土壤重金屬污染的因素

3.1 pH

生物體表面有吸附作用的金屬位點會受到pH的影響，也會進一步影響金屬離子的化學狀態。當pH很低時，溶液中含有大量的H+，與生物體表面的金屬吸附位點發生反應，阻礙了重金屬離子與金屬吸附位點的結合，吸附作用受到抑制。當pH緩慢升高時，溶液中H+濃度減少，微生物細胞表面重金屬吸附位點變多，更有利于金屬離子與金屬吸附位點的結合，但pH超過某一限值時吸附效率又會降低[15]。GIRI等[29]發現，當pH在2.5～7.5時，蠟樣芽孢桿菌吸收砷的效率隨著pH的升高而增大；pH超過7.5時，吸收效率逐漸降低。

3.2 吸附時間

重金屬離子的生物吸附可分為兩個階段。第一個是快速吸附階段，因為細胞表面有很多可以與重金屬離子結合的吸附點；第二個則是慢速吸附階段，這一階段中隨著細胞表面吸附點的減少，反應速率也隨之減少。李明春等[30]研究啤酒酵母菌吸附Cu2+、Cd2+、Ni2+這3種重金屬離子的吸附程度發現，這3種重金屬被吸附反應速度都快，在1 h內Cu2+的吸附量最多。

3.3 重金屬濃度

重金屬離子吸附過程中，重金屬離子的濃度起到了重要的作用。重金屬離子濃度升高，微生物的吸附量也增大，與吸附時間機制相同，當重金屬離子濃度很高的時候，吸附量反而會降低。將吸附量最大時的重金屬離子濃度，定義為吸附飽和濃度。當細胞表面的吸附點有限時，隨著溶液中重金屬離子濃度的增大，吸附點逐漸減少，其反應效率也逐漸降低。

3.4 化學預處理

借助加熱、降溫等預處理方法，對具有生物吸附性能的材料進行處理，使吸附性質發生變化的過程稱為化學轉化。經過處理的生物吸附材料可出現較多的吸附位點，吸附位點的增多使吸附效率得到大幅度提升。吳娟等[31]研究白腐真菌吸附鉛的機理發現，NaOH處理過的菌體吸附能力顯著提高；在NaOH濃度為0.1 mol/L時，白腐真菌對鉛的吸附量最大；可能是因為細胞中的部分雜質被氫氧化鈉溶解從而暴露出更多的位點，進而增大了對重金屬離子的吸附量。

3.5 溫度

從理論上講，重金屬的吸附能力會隨著溫度的升高而增加，但不同的生物吸附材料可以承受的溫度不同，有些微生物耐受溫度范圍較廣，但有些微生物耐受溫度范圍較小，從而受溫度影響程度大，溫度過高或過低都會影響吸附效率。張敬華等[32]研究啤酒酵母吸附Pb2+機制發現，在同一Pb2+質量濃度下，隨著溫度的升高，啤酒酵母吸附Pb2+的速率逐漸增加。

3.6 共存離子

工業廢水中包含了各種各樣的重金屬離子，這些金屬離子與所研究的重金屬離子形成競爭關系，占據細胞表面的活性位點，從而導致吸附效率降低。干擾離子也會對試驗離子產生一定的影響，與試驗離子發生相互作用，進而影響吸附效率。牛慧等[33]發現，在pH值為4.5的條件下，含有Zn2+、Cd2+、Cu2+或As3+等離子的鉛污染廢水中，Cu2+、As3+對Pb2+吸附量沒有影響，Cd2+使Pb2+吸附量增加，而Zn2+使Pb2+吸附量減少。

3.7 其他因素

除上述因素外，還有很多其他因素也會對生物吸附造成影響。如金屬離子適應吸附劑的能力、活性菌株存活時間、營養元素多樣性、吸附劑微粒的粒徑等，這些因素都會導致生物吸附效率有一定的變化。在實際使用過程中，首先需要明確合適的條件和方法，這樣才能使吸附效率達到最大[15]。

4 結語

耐重金屬微生物菌株的分離篩選主要影響因素是培養基和篩選方法，菌株的最大耐受濃度可以通過直接觀察菌種形態特征確定。耐性菌株的抗性機理主要是通過離子交換、氧化還原、酶促反應以及與重金屬離子的相互作用降低對微生物的毒害作用。在研究微生物修復土壤重金屬污染的影響因素時，除了單因素的影響外，多個因素間的相互作用也應受到重視。因此，在以后耐重金屬微生物篩選和修復土壤重金屬污染的影響因素研究中，要更加注重多種因素相互作用的影響和研究，以能夠高效分離得到耐性新菌株、全面提高修復效率。