胱抑素C在全自動生化分析儀上檢測的鉤狀效應研究

林育婷

（英科新創（廈門）科技股份有限公司，福建廈門361000）

胱抑素C（Cystain C，Cys C）又名半胱氨酸蛋白酶抑制劑（Cysteine Proteinase Inhibitor，CPI），是一種非糖基化的堿性蛋白質，相對分子質量較小，在體內唯一的代謝途徑是通過腎小球濾過排泄。自1985年以來，胱抑素C已被視為檢測腎功能的良好標志物，可作為腎小球濾過功能的監測指標，是一種理想的內源性標志物，在一系列生理病理過程中也發揮著作用，有重要的臨床意義[1]。

胱抑素C的測定方法很多，目前使用較廣泛的是在全自動生化分析儀上使用的透射免疫比濁法[2]。透射免疫比濁法的檢驗原理是反應生成不溶性的抗原-抗體復合物，并產生一定的濁度，所以濁度值直接反映樣品中抗原的含量。透射免疫比濁法雖然具有操作簡單、測定速度快、無污染、自動化的優勢，但在檢測高濃度標本時，會因抗原過量產生鉤狀效應使反應信號減弱，從而導致檢測結果偏低[3]。不同品牌的檢測儀器，因信號量程、測定程序、數據分析模式等的不同，發生抗原過量鉤狀效應的結果可能不同。本文對研制的胱抑素C試劑在兩種全自動生化分析儀上的鉤狀效應結果進行比較，分析其對臨床結果造成偏差的風險，并設法減小這種風險。

1 材料與方法

1.1 材料

抗原，北京百川飛虹生物科技有限公司；抗體，購自DAKO公司；胱抑素C測定試劑，英科新創（廈門）科技股份有限公司；胱抑素C基礎緩沖液，英科新創（廈門）科技股份有限公司。

1.2 儀器

Hitachi 7180全自動生化分析儀，吸光度測定量程-3.2～3.2，日本日立公司；Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀，吸光度測定量程-2.5～2.5，美國貝克曼庫爾特公司。

1.3 方法

1.3.1 測定程序

Hitachi 7180全自動生化分析儀測定程序：測定波長546 nm，測光點18～34，測定模式為兩點終點法，定標方式為6點定標（Logit-log（4P）擬合）。

Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀測定程序：測定波長540 nm，測光點14～27，測定模式為終點法，定標方式為6點定標（Spline擬合）。

1.3.2 不同濃度梯度的胱抑素C抗原溶液的制備

將胱抑素C抗原用胱抑素C基礎緩沖液復溶，配制成理論濃度為0 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、4.0 mg/L、6.0 mg/L、8.0 mg/L、10.0 mg/L、12.0 mg/L、14.0 mg/L、16.0 mg/L、18.0 mg/L、20.0 mg/L、25.0 mg/L、30.0 mg/L、35.0 mg/L、40.0 mg/L、45.0 mg/L及50.0 mg/L的19個濃度梯度。

1.3.3 繪制劑量-效應曲線

將上述19個濃度的胱抑素C抗原溶液分別在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上進行檢測，每個樣品重復檢測3次，以3次檢測結果的反應吸光度均值為縱坐標，胱抑素C抗原溶液的理論濃度為橫坐標，用Excel表格做出相應的散點圖和趨勢線，繪制成劑量-效應曲線。根據曲線，對胱抑素C在兩種儀器上的鉤狀效應進行比較分析。

1.3.4 鉤狀效應差異的改善方法

分別采用不同濃度的抗體用量（75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L）配制胱抑素C試劑，按上述方法進行試驗，根據結果判斷是否能解決不同檢測儀器間鉤狀效應差異的問題。

2 結果與分析

2.1 兩種儀器的劑量-效應曲線

從圖1、圖2可以看出，不同抗體用量配制的胱抑素C試劑，在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上測定0～50 mg/L的不同濃度梯度的抗原溶液，均存在明顯的鉤狀效應。樣品的反應吸光度起初隨著抗原濃度的升高而升高，在到達平衡點濃度之后反應吸光度隨著抗原濃度的升高反而減小。如圖1所示，當試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和 150 mg/L時， 在7180分析儀上測定胱抑素C抗原，其抗原-抗體結合達到平衡點時的抗原濃度（即HOOK濃度）分別約為 12 mg/L、14 mg/L、18 mg/L和 18 mg/L，超過以上濃度后劑量-效應曲線呈下降趨勢。如圖2所示，當試劑的抗體用量分別為75 mg/L、100 mg/L、125 mg/L和150 mg/L時，在AU680分析儀上測定胱抑素C抗原，其抗原-抗體結合達到平衡點時的HOOK濃度分別約為10 mg/L、12 mg/L、12 mg/L和10 mg/L，超過以上濃度后劑量-效應曲線呈下降趨勢。

圖1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在日立7180上的劑量-效應曲線

圖2 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑在AU680上的劑量-效應曲線

2.2 鉤狀效應差異分析

不同抗體用量配制的胱抑素C在Hitachi 7180和Beckman Coulter AU680全自動生化分析儀上雖然有類似的鉤狀效應趨勢，但出現鉤狀效應的HOOK濃度有所區別：在7180分析儀上，隨著試劑抗體濃度的增加，出現鉤狀效應的HOOK濃度也有較明顯增加；在AU680分析儀上，隨著試劑抗體濃度的增加，出現鉤狀效應的HOOK濃度增加不明顯，且相同抗體用量配制的胱抑素C在AU680分析儀上的HOOK濃度均比在7180分析儀上低。此種情況的發生，可能為AU680儀器的測定量程較小（最大測定量程為2.5），當試劑抗體濃度大于125 mg/L時，反應吸光度已接近儀器的最大量程，所以隨著抗體濃度的增加，儀器測定量程的限制可能影響了測定結果的準確性（見表1）。此外，儀器的加樣時間點、測光點、數據擬合方式不同，也可能是造成此種現象的原因[4]。

表1 不同抗體用量配制的胱抑素C試劑出現鉤狀效應的HOOK濃度和反應吸光度

有研究表明，試劑中抗體濃度越高，所能準確測量到的抗原濃度也越高，試劑安全報告范圍也越寬，鉤狀效應出現的概率會大大減小[5]。但試劑在臨床應用上，需要適配多種型號的儀器，儀器的測量差異也應是試劑研發過程中需要綜合考慮的。本產品胱抑素C試劑的線性范圍要求為0～8 mg/L，健康成人血清胱抑素C的參考范圍為0.59～1.03 mg/L，臨床患者血清胱抑素C濃度在12 mg/L以上的也較少，因此綜合考慮試劑的質量要求、儀器的測量差異以及臨床檢測的需求，選擇本試劑的抗體濃度為100 mg/L。選擇此抗體濃度，在7180分析儀中的HOOK濃度約為14 mg/L，在AU680分析儀上的HOOK濃度約為12 mg/L，二者均超過試劑線性范圍要求的上限，對于在線性范圍之內的樣本，均能保證檢測結果的準確性，也能覆蓋臨床常見的樣本濃度。

3 結論

鉤狀效應是免疫比濁試劑不可避免的問題，本試劑在研發過程中，在優化配方的同時，也綜合考慮了儀器的測量差異，根據研究結果確定了抗體的最佳用量。同時，通過此研究，對所研制的試劑有了更準確的HOOK效應數據，以此指導臨床檢測過程中對抗原超限標本進行稀釋處理，避免在檢測過程中由于檢測儀器的不同而造成超高值標本檢測結果的不準確。