基于HMMER算法鑒定基因家族在本科創(chuàng)新實驗中的設(shè)計與實踐

裴會敏，方遠鵬，王芬，謝鑫*

（1.黔南民族師范學(xué)院 生物科學(xué)與農(nóng)學(xué)院，貴州都勻 558000；2.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州貴陽 550025）

基因家族是單個基因在進化過程中產(chǎn)生重復(fù)與 拷貝而形成的、具有相同祖先的基因集合，廣泛存在于真核生物中，在結(jié)構(gòu)和功能上具有高度的相似性[1-4]。基因家族的研究是反向遺傳學(xué)中最重要的理論依據(jù)之一[5]。采用傳統(tǒng)BLAST算法進行直接比對時，一方面存在獲取最優(yōu)結(jié)果時會產(chǎn)生遺漏的問題，另一方面P-value取值精度會較低[6]。HMMER算法是為解決對難以統(tǒng)計和預(yù)測的多種外部因素的識別問題而開發(fā)的，如今已成為統(tǒng)計學(xué)、生物信息學(xué)、模式識別等多個領(lǐng)域的關(guān)鍵算法；特別是在生物學(xué)研究上，其相關(guān)算法的識別效率已達到較高的精確度，與BLAST算法相比耗時更少[7-8]。

生物課程教學(xué)不僅應(yīng)當(dāng)注重趣味性，還應(yīng)注重與實際應(yīng)用接軌[9-11]。HMMER算法鑒定基因家族流程成熟，使用頻率也越來越高，因此從實驗室轉(zhuǎn)向本科生課堂變得尤為迫切。為了讓學(xué)生更好地理解和運用該方法，本創(chuàng)新實驗讓學(xué)生自主選取目標物種和基因家族，對該家族進行鑒定并對結(jié)果進行分析，最后對所得數(shù)據(jù)進行可視化分析。

本創(chuàng)新課程集虛擬機的安裝與使用、Linux系統(tǒng)下軟件安裝與簡單命令的使用、HMMER軟件的安裝與使用、基因組的分析與可視化等實驗于一體，要求學(xué)生自主完成全部實驗，強調(diào)對學(xué)生能力的培養(yǎng)以及掌握多種簡單生物信息學(xué)研究的原理和基本分析方法，可為生物信息學(xué)實驗課、現(xiàn)代分子生物學(xué)實驗課等課程的教學(xué)提供參考。

1 課程內(nèi)容設(shè)計

本課程為大學(xué)生創(chuàng)新性實驗計劃課程，授課對象為具有一定計算機理論基礎(chǔ)的二年級和三年級本科生，是植物保護及相關(guān)農(nóng)業(yè)類學(xué)科的個性化選修課程。整個實驗課程為一個設(shè)計型實驗“基于HMMER算法鑒定基因家族”。主要通過以下步驟實施：（1）讓學(xué)生自主選擇與自己專業(yè)有關(guān)的物種和基因家族，對基因家族的結(jié)構(gòu)進行初步認識；（2）利用HMMER算法對基因家族進行鑒定并采用多種軟件對其進行深入分析；（3）指導(dǎo)學(xué)生完成共線性分析，提升學(xué)生對基因家族鑒定的認識。本課程通過學(xué)生自主操作完成所有步驟，使學(xué)生的動手能力以及自學(xué)能力得到較好的鍛煉。課程的主要內(nèi)容包括目標家族的挑選和分析、基因家族成員的獲得、進化樹的構(gòu)建與評價、結(jié)構(gòu)信息的可視化和共線性分析。

由于各專業(yè)本科生課程時間不同，本課程均安排在周六，共分為5次實驗及1次總結(jié)匯報，每次實驗時間2～4 h，共16～22學(xué)時。為提升實驗教學(xué)效果，3人一組，共10組進行實驗。具體課程內(nèi)容和安排如表1所示。

表1 課程內(nèi)容和安排

2 代表性結(jié)果

以2019年第一學(xué)期第三組學(xué)生的實驗為例，該組學(xué)生選擇的基因家族為高粱（Sorghum bicolor）的SQUAMOSA啟動子結(jié)合蛋白（SQUAMOSA Promoter Binding Protein，SBP），該家族對表觀遺傳有重要作用。

TAIR數(shù)據(jù)庫[12]搜索該基因家族的結(jié)構(gòu)域為SBP。（1）應(yīng)用Pfam數(shù)據(jù)庫[13]搜索相關(guān)結(jié)構(gòu)域的種子文件，SBP（PF03110）；利用HMMER-3.1篩選NCBI內(nèi)的高粱蛋白數(shù)據(jù)庫，保留P＜0.05的所有成員。（2）運用SMART、Pfam、NCBI-CD對成員進一步篩選、驗證（P＜0.05），然后通過Softberry及Prot-Paramtool[14]預(yù)測高粱SBP蛋白的理化性質(zhì)。（3）根據(jù)NCBI內(nèi)的高粱基因數(shù)據(jù)庫注釋文件以及（基因、cDNA、蛋白）序列文件進行位置和序列信息的提取，并通過MCScan X[15]軟件鑒定高粱基因組內(nèi)的全部共線性基因?qū)Γ肕G2C完成高粱SBP基因家族的染色體定位，通過MEME和GSDS軟件[16]預(yù)測基因結(jié)構(gòu)和保守基序。（4）應(yīng)用MEGA7構(gòu)建水稻、番茄、玉米、葡萄的SBP基因家族成員進化樹（見圖1）。

圖1 水稻、番茄、玉米、葡萄和高粱SBP家族進化分析

有趣的是，學(xué)生在本次實驗中發(fā)現(xiàn)他人已發(fā)表文章數(shù)據(jù)存在一些不足：該組同學(xué)發(fā)現(xiàn)高粱SBP基因家族共19個成員，比之前的研究[17]多出3個全新的成員，分別為SbSBP19/20/21，其中SbSBP19與SbSBP20是一個共線性對；其次，發(fā)現(xiàn)已經(jīng)發(fā)表的SbSBP5、SbSBP13、SbSBP14的氨基酸及CDS長度可能存在錯誤，同學(xué)們試圖對其進行糾正[5]。如圖2所示，學(xué)生還利用MCScan X對高粱SBP基因家族與TAIR和Ensembl數(shù)據(jù)庫（http://plants.ensembl.org/）的水稻、玉米、擬南芥基因組進行種間共線性的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)SbSBP20基因是高粱SBP基因家族中獨特的基因，與其他植物間均不存在共線性關(guān)系；此外，還發(fā)現(xiàn)高粱與玉米的共線性最多，其次是水稻，再次為擬南芥。

圖2 水稻（A）、玉米（B）、擬南芥（C）和高粱SBP家族共線性特征

3 實驗教學(xué)總結(jié)

如表2所示，17%的實驗組能在自主學(xué)習(xí)下完成實驗，77%的實驗組能在老師的指導(dǎo)下完成實驗，6%的實驗組不能完成實驗。教學(xué)效果表明該實驗適合具有分子生物學(xué)和基本生物信息學(xué)基礎(chǔ)的高年級本科生。學(xué)生在課程最后需要提交實驗報告和學(xué)習(xí)總結(jié)，并做PPT匯報。從匯報情況來看，學(xué)生對項目背景、材料與方法、實驗過程和結(jié)果都有清晰的認識；從學(xué)習(xí)總結(jié)來看大部分同學(xué)對實驗各環(huán)節(jié)掌握得比較好，其中少部分同學(xué)對實驗原理的理解比較深入。

表2 實驗結(jié)果統(tǒng)計

4 教學(xué)效果

4.1 增強學(xué)生對基因家族鑒定的理解

自20世紀以來，生物新技術(shù)和新理論不斷出現(xiàn)，生物數(shù)據(jù)的處理成為影響生物學(xué)科發(fā)展的關(guān)鍵。作為21世紀的本科生，有必要掌握一些生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件，了解一些計算機的編程語言。本課程是對生物信息學(xué)與創(chuàng)新實驗的融合，將學(xué)生的思維從單純的生物實驗轉(zhuǎn)換到交叉性實驗。本實驗由學(xué)生自主選取目標家族，利用在線數(shù)據(jù)庫與開放軟件對物種的全基因組進行家族鑒定，學(xué)生課程參與感極強，實驗完成后也很有成就感，充分體驗了學(xué)術(shù)研究的樂趣，甚至有學(xué)生表示在實驗過程中發(fā)現(xiàn)了自己的興趣方向。

4.2 提升學(xué)生的動手能力和分析能力

該實驗教學(xué)直接以“基于HMMER算法鑒定基因家族”項目為基礎(chǔ)，學(xué)生切實參與了整個實驗過程，非常鍛煉學(xué)生的學(xué)習(xí)能力與動手能力。有些學(xué)生發(fā)現(xiàn)進行基因家族的鑒定后，不同數(shù)據(jù)庫的注釋存在差異，從而加深學(xué)生對交叉實驗的理解。課程結(jié)束后，仍有部分同學(xué)向任課老師進行咨詢，如有的同學(xué)難以安裝某個生物軟件、有的無法對SSR數(shù)據(jù)進行建樹、有的對軟件的使用存在疑惑等。本課程符合當(dāng)下對生物類、農(nóng)業(yè)類、醫(yī)學(xué)類本科生的培養(yǎng)目標，值得積極推廣。

4.3 推廣實驗教學(xué)

本課程要求學(xué)生具有一定的分子生物學(xué)和計算機基礎(chǔ)。經(jīng)過5個學(xué)期的教學(xué)實踐，發(fā)現(xiàn)無分子生物學(xué)基礎(chǔ)的同學(xué)在操作計算機時無法很好地理解實驗的意義；無計算機基礎(chǔ)的同學(xué)，有的甚至無法跟隨老師完成軟件的安裝。目前，國內(nèi)高校基本具備實施本實驗的條件，并且本課程中采用的數(shù)據(jù)庫和軟件都可免費獲得，本實驗教學(xué)法可在國內(nèi)廣泛推廣。