蛹蟲草滴丸的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)

唐浩入，韓禹鑫，張志同，江鑫，張玥，郭坤鵬，劉雪潔

（天津天獅學(xué)院 醫(yī)學(xué)院，天津 301700）

蛹蟲草 [Cordyceps militaris（L.） Link]，又稱北冬蟲夏草、北蟲草，是一種常用的食藥用真菌，屬子囊菌亞門（Ascomycotina）麥角菌科（Clavicipitaceue）蟲草屬（Cordyceps），與冬蟲夏草同屬[1]。研究發(fā)現(xiàn)，蛹蟲草有著多種有效成分，其中的蟲草多糖和腺苷分別具有免疫調(diào)節(jié)功能[2-3]、抗腫瘤[4-5]、降血糖[6-7]和改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常[8-9]、保護(hù)腎臟[10]等藥理作用。蛹蟲草與天然冬蟲夏草功效相似，近年來逐步成為冬蟲夏草的替代品[11]，具有良好的應(yīng)用前景，目前蛹蟲草的應(yīng)用形式有膠囊、口服液、顆粒、片劑和粉末等。為了實(shí)現(xiàn)溶出快、穩(wěn)定性好、生物利用度高及制備工藝簡(jiǎn)單的目標(biāo)，本研究擬將蛹蟲草提取物制作成滴丸并進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，為蛹蟲草滴丸的深入研究和開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

SY-2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；TD6002C型電子天平，天津天馬衡基儀器有限公司；ME204型萬分之一電子天平，METTLER TOLEDO；DHG-9140A型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科技儀器有限公司；SS-1022型直立式粉碎機(jī)，東莞市幕荷商貿(mào)有限公司；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；CL型恒溫加熱磁力攪拌器，金壇市金祥龍華電子有限公司；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵，上海亞榮生化儀器廠；3-18KS型臺(tái)式冷凍離心機(jī)，SIGMA（德國(guó)）；RC1207DP型溶出試驗(yàn)儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州天瑞儀器有限公司；UH5300型紫外可見分光光度計(jì)，日立科學(xué)儀器（北京）有限公司；1220 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀，Agilent。

蛹蟲草，亳州仙太生物藥業(yè)有限公司；甲醇，色譜純，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司；腺苷，99.85%，成都麥德生科技有限公司；濃硫酸、PEG6000，分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蒽酮，分析純，合肥巴斯夫生物科技有限公司；液體石蠟、無水乙醇，分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；無水葡萄糖，分析純，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司；超純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 提取蛹蟲草有效成分

因蛹蟲草中含有蟲草多糖、核苷類化合物、甾醇類、蛋白質(zhì)等多種有效成分[12]，故實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的乙醇水溶液使用回流的方式對(duì)蛹蟲草的有效成分進(jìn)行提取。

稱取150 g蛹蟲草子實(shí)體于80℃電熱鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘30 min，用粉碎機(jī)粉碎干燥子實(shí)體，稱取100 g蛹蟲草粉末置500 mL圓底燒瓶中。加入500 mL的95%乙醇溶液回流1h，濾出殘?jiān)凑沾朔ɡ^續(xù)用500 mL的60%乙醇和500 mL蒸餾水依次回流提取1h[13]。合并3次回流提取液，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至糖漿狀后趁熱轉(zhuǎn)移到干燥恒重的蒸發(fā)皿中，80 ℃水浴蒸至60 g，得到蛹蟲草浸膏。

1.3 滴丸制備工藝的選擇

1.3.1 基質(zhì)與冷凝液的選擇

因PEG6000具有良好的水溶性、分散力和內(nèi)聚力且安全無刺激；液體石蠟安全無害，不溶解料液與基質(zhì)，不與其發(fā)生反應(yīng)，故選PEG6000作為制備滴丸的基質(zhì)，液體石蠟作為冷凝劑，進(jìn)行預(yù)滴。

1.3.2 浸膏與基質(zhì)比例的選擇

為了考察浸膏與PEG6000比例對(duì)制備滴丸的影響，實(shí)驗(yàn)分別取蟲草浸膏與基質(zhì)按照質(zhì)量比為1∶1.5、1∶2.0和1∶2.5進(jìn)行滴丸的制備，以滴丸的外觀形態(tài)為標(biāo)準(zhǔn)選擇最優(yōu)比例。

1.3.3 料液溫度的選擇

選擇料液溫度為70 ℃、80 ℃、90 ℃，在同一滴制條件下滴入5 ℃液體石蠟中觀察滴丸成型的情況。

1.3.4 滴距與滴速的選擇

在滴距為4～12 cm處進(jìn)行滴丸的制備并觀察滴丸的外觀，選擇合適的滴距，在滴丸成型度好的條件下選擇合適的滴速。

1.4 蛹蟲草滴丸的質(zhì)量評(píng)價(jià)

1.4.1 滴丸性狀與重量差異限度

評(píng)價(jià)蛹蟲草滴丸的外觀，并根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（2020版）》中丸劑重量差異限度的要求[14]，精密稱定20粒蛹蟲草滴丸的總重量，求得平均丸重，再分別精密稱定每粒丸的重量，將每粒丸重與平均丸重比較，計(jì)算重量差異。

1.4.2 繪制硫酸-蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密稱取10 mg無水葡萄糖置100 mL容量瓶中，加水定容至刻度，搖勻得葡萄糖對(duì)照品溶液。精密稱取0.1 g蒽酮加入100 mL的80%硫酸溶液溶解，搖勻，棕色瓶保存[15]。分別精密吸取0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL葡萄糖對(duì)照品溶液于試管中，加水至1.5 mL再加無水乙醇至3.5 mL。精密加入6 mL硫酸-蒽酮顯色液，混勻，水浴加熱15 min后取出冷卻，以等量蒸餾水為空白，在625 nm處測(cè)定溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3 繪制腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定腺苷含量，色譜條件如下。Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相為75%甲醇水溶液；進(jìn)樣量10 μL；流速為1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm[16]。

配 置 溶 液 濃 度 為 1.04 μg/mL、2.08 μg/mL、4.16 μg/mL、41.60 μg/mL和 416.00 μg/mL的一系列腺苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 滴丸體外溶出度測(cè)定

蟲草多糖和腺苷為蛹蟲草有效成分中的代表性物質(zhì)，故選用這兩種有效成分作為溶出度測(cè)定的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

稱取1.90g蛹蟲草滴丸，根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典（2020版）》溶出度與釋放度測(cè)定法（籃法）[14]129-130進(jìn)行溶出操作。溶出條件：溶劑為900 mL蒸餾水，溫度為37 ℃，轉(zhuǎn)速為100 r/min。分別在5 min、15 min、30 min、60 min、120 min和 180 min取 樣5 mL，快速將樣液用0.45 μm的微孔濾膜過濾，吸取1.5 mL濾液，加入乙醇至3.5 mL，搖勻，根據(jù)1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算溶出的多糖濃度；繼續(xù)吸取1mL濾液，根據(jù)1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定溶出的腺苷含量。以180 min溶出的多糖和腺苷含量為完全溶出含量，繪制溶出曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 滴丸制備工藝選擇

（1）基質(zhì)與冷凝液：預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)以PEG6000為基質(zhì)，液體石蠟為冷凝劑制備的滴丸下降速度適宜，滴丸成型好，無黏連，符合要求。

（2）浸膏與基質(zhì)比例：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在相同滴制條件下，1∶1.5比例的料液黏度大，無法進(jìn)行滴制；1∶2.0比例的料液滴制的滴丸有較好的圓整度，無拖尾，但滴丸有黏連，冷凝不均；1∶2.5比例制備的滴丸成型好，無黏連，色澤均勻，冷凝均勻。故選用蟲草浸膏與基質(zhì)質(zhì)量比為1∶2.5混合后制備滴丸。

（3）料液溫度：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在70 ℃時(shí)，料液黏度大，滴制不便；在90 ℃時(shí)，料液黏度小，但滴丸有黏連，不符要求。故選擇80 ℃作為合適的料液溫度。

（4）滴距與滴速：實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滴距在6～8 cm，滴速為20～40滴/min條件下制備的滴丸成型度好，故本實(shí)驗(yàn)選擇的滴距為6 cm，滴速為40滴/min。

2.2 滴丸質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.2.1 滴丸性狀與重量差異限度

（1）性狀：按照2.1所述工藝制備的蛹蟲草滴丸外觀圓整、大小與色澤均勻、無拖尾和氣泡、無黏連、無裂紋，符合要求。

（2）滴丸重量差異限度：求得平均丸重為0.025 5 g，僅有一丸與平均丸重差異17%，超出重量差異限度（15%），符合藥典規(guī)定。

2.2.2 硫酸-蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制得到如圖1所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.002 4x+0.001 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 7，方程擬合程度較好。

圖1 硫酸-蒽酮法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.3 腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以峰面積作為縱坐標(biāo)，濃度作為橫坐標(biāo)，得如圖2所示的線性回歸方程：y=29.829x+137.03，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6，方程擬合程度較好。

圖2 腺苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 溶出度測(cè)定結(jié)果

從圖3和圖4可知，蟲草多糖在15 min溶出度達(dá)到了98.73%，腺苷在15 min溶出度達(dá)到98.87%，符合《中華人民共和國(guó)藥典（2020版）》滴丸劑30 min溶散時(shí)限要求[14]132-135。

圖3 蛹蟲草滴丸多糖溶出曲線

圖4 蛹蟲草滴丸腺苷溶出曲線

3 結(jié)論

本研究成功制備了蛹蟲草滴丸并進(jìn)行了質(zhì)量評(píng)價(jià)。選擇的制備工藝為：蛹蟲草浸膏與PEG6000質(zhì)量比1∶2.5，料液溫度80 ℃，冷凝溫度5 ℃，冷凝液為液體石蠟，滴距6 cm，滴速40滴/min。制備的蛹蟲草滴丸圓整度好、大小與色澤均勻、無拖尾和氣泡、無黏連和無裂紋。滴丸重量差異限度、有效成分多糖和腺苷體外溶出時(shí)限均符合藥典規(guī)定。蛹蟲草滴丸的制備工藝簡(jiǎn)單且滴丸有效成分溶出快，具有一定的應(yīng)用前景，可為蛹蟲草滴丸的深入研究和開發(fā)利用提供實(shí)踐和理論基礎(chǔ)。