一種用于proCPB可溶性表達的新型表達系統

文良柱，方宏清，韋炎龍，竇俊

（江蘇萬邦醫藥科技有限公司，江蘇徐州 221004）

羧肽酶B（Carboxypeptidases B，CPB）是一種含金屬鋅的蛋白酶，可水解蛋白質或多肽類底物C端的精氨酸（Arg）或賴氨酸（Lys），在藥物的生產、科學研究以及急性胰腺炎的診斷等方面具有重要作用[1-2]。特別是在胰島素原轉化為胰島素的過程中，CPB是不可缺少的工具酶之一[3]。目前，活性CPB的制備方法主要分為兩種：（1）直接從豬胰腺中提取并純化，但是這種方法價格昂貴，且制品中殘留其他酶類或病毒等，限制了其應用范圍；（2）利用微生物（原核或真核表達系統）發酵的方法表達CPB的酶原（proCPB），純化后去除N末端前肽獲得具有催化活性的酶體[4-5]。相比于真核表達系統，原核表達系統，尤其是大腸桿菌（Escherichia coli），具有遺傳背景清晰、基因工程操作手段成熟、宿主生長能力強等優點，是理想的外源蛋白表達宿主之一。但是，大腸桿菌表達包括豬羧肽酶原B（proCPB）在內的很多外源蛋白均是以包涵體的形式存在于細胞中，后續還需對產物進行復性，操作復雜且復性率低[6]。

CPB含有7個半胱氨酸，其中1個半胱氨酸呈游離態，另外6個形成3對二硫鍵。大腸桿菌缺乏真核細胞中翻譯后修飾的酶類，并且細胞質環境呈還原型，不利于二硫鍵形成，外源蛋白極易形成包涵體。在宿主細胞中，將外源蛋白從包涵體轉為天然構象并以可溶性蛋白的形式存在，可降低蛋白質的工業生產成本。一些輔助蛋白能夠協助蛋白質組裝或介導蛋白質正確折疊，將目的蛋白與之共表達是避免包涵體形成的有效手段之一。常用的輔助蛋白包括熱休克蛋白分子伴侶以及一些參與蛋白質異構化反應的酶類，如蛋白質二硫鍵異構酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）、肽酰-脯氨酰順反異構酶（Peptidyl-Prolylcis-transIsomerase，PPI）等。

在真核細胞中，PDI是內質網上氧化蛋白折疊的關鍵酶，氧化底物后自身被還原，隨后被巰基氧化酶（Sulfhydryl Oxidase，SO）重新氧化[7]。因此，構建SO-PDI聯合表達體系，有望實現proCPB的可溶性表達。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 材料與試劑

CPB甘油菌（E.coliBL21(DE3)/p0E-TS/pETCPB）的宿主E.coliBL21（DE3），貨號CB105-01，天根生化科技（北京）有限公司。

蛋白胨、酵母提取物，英國OXOID公司；瓊脂粉、氯化鈉，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖，法國Biowest公司；氯霉素、卡那霉素、四環素，美國AMRESCO公司；重組克隆試劑盒（CU201-02），北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 儀器

HR40-ⅡA2生物安全柜，青島海爾特種電器有限公司；UV-2100紫外分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司；202-OAB電熱恒溫培養箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HNY-200B臺式全溫控搖床，天津歐諾儀器股份有限公司；HW.SY11-KP2恒溫水浴鍋，北京長風儀器儀表公司；H2O3-100C金屬浴，卡尤迪生物科技（北京）有限公司；Veriti PCR擴增儀，美國ABI公司；3K-18KS離心機，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；DYY-2C電泳儀，北京市六一儀器廠；BL-620S電子天平，日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒構建

所有質粒的體外重組操作利用重組克隆試劑盒完成，詳細信息如表1所示。

表1 質粒信息

1.2.2 培養條件及蛋白表達

挑取單菌落至含有5 mL液體LB培養基的試管中，在37 ℃、220 r/min條件下培養10～12 h。氨芐青霉素（Amp，50 μg/mL）、氯霉素（Cm，25 μg/mL）和卡那霉素（Kan，25 μg/mL）根據質粒所攜帶抗生素基因按照要求使用。

挑取單菌落至含有5 mL液體LB培養基的試管中，在37 ℃、200 r/min條件下培養10～12 h。將菌液轉接至含有50 mL液體LB培養基的搖瓶中，使初始OD600為0.1，在37 ℃、200 r/min繼續培養。以菌株E. coliBL21(DE3)為宿主時，如外源蛋白啟動子為阿拉伯糖，則在OD600為0.3～0.4時加入2 mg/mL的L-阿拉伯糖；如外源蛋白啟動子為T7，則在OD600為0.6～0.8時加入0.3 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）。在20 ℃、200 r/min的條件下繼續培養15 h，收集菌體并稀釋到合適的濃度，超聲破碎分離可溶性蛋白和包涵體蛋白，總蛋白樣品不進行超聲破碎。利用SDS-PAGE電泳對蛋白表達進行鑒定。

1.2.3 菌株傳代培養

將保藏的CPB甘油菌涂布于含有Amp和Cm的LB平板，倒置于37 ℃的恒溫培養箱中孵育約20 h。挑取單菌落至含有Amp和Cm液體LB培養基（5 mL）的試管中，37 ℃、200 r/min孵育約12 h，記為第0代；吸取50 μL第0代菌液至含有Amp和Cm的液體LB培養基（5 mL）中，37 ℃、200 r/min孵育約12 h，記為第1代（有抗）……如此操作直至獲得第21代（有抗）。

在第0代菌液基礎上，按照上述的傳代培養方法，但全過程不添加抗生素，獲得第11代（無抗）和第21代（無抗）。同樣按照1.2.2蛋白表達方法，但全過程不添加抗生素，研究不添加抗生素時可溶性表達系統穩定性。

1.2.4 基因

SO蛋白質序列參照來源于釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeS288C）的ERV1（NCBI VERSION：P27882.2）設計改造，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成對應基因并克隆到pUC57載體上（pUC57-ERV1）。

PDI來源于人（hPDI）或釀酒酵母（sPDI）或大腸桿菌（DsbC），hPDI的氨基酸序列參照NCBI VERSION：NP_000909.2序列設計改造，sPDI的氨基酸序列參照NCBI VERSION：AAA34848.1序列，DsbC的核酸序列（dsbC）來源于E. coliBL21(DE3)基因組（NCBI VERSION：CP001509.3）。這三個蛋白對應的基因序列連同RBS序列、終止子序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到pUC57載體上，獲得質粒pUC57-hPDI、pUC57-sPDI和pUC57-dsbC。

proCPB的蛋白序列來源于歐亞野豬（Sus scrofa，NCBI VERSION：CAB46991.1），但去掉2～15位信號肽氨基酸序列，核酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并克隆到到質粒pET21b骨架NdeI、XhoI位點上，獲得質粒pETCPB。

2 結果與分析

2.1 N末端標簽優化策略實現SO和PDI的可溶性表達

誘導菌株 BL21(DE3)、WF1、WF2及 WF3表達對應的巰基氧化酶（ERV1）和蛋白質二硫鍵異構酶（hPDI、sPDI或DsbC），可溶性蛋白和包涵體蛋白SDS-PAGE電泳結果如圖1（A）所示，ERV1（21.70 kDa）、hPDI（52.05 kDa）、sPDI（55.70 kDa）和DsbC（23.51 kDa）均未出現明顯條帶。將巰基氧化酶和蛋白質二硫鍵異構酶基因的啟動子更換為強度更強的T7啟動子，可溶性蛋白和包涵體蛋白SDSPAGE電泳結果如圖1（B）所示。結果表明，更換啟動子仍不能實現hPDI和sPDI的可溶性表達。

圖1 巰基氧化酶和二硫鍵異構酶的蛋白表達

優化ERV1、hPDI、sPDI或DsbC的N末端標簽（添加Trx標簽、T7標簽或GST標簽）增強蛋白的可溶性表達能力。如圖2（A）所示，ERV1、TrxERV1、T7ERV1以及GSTERV1均能夠產生可溶性蛋白，TrxERV1可溶性表達效果最優、ERV1次之；如圖2（B）所示，TrxhPDI、T7hPDI以及GSThPDI可溶性表達效果較好，而hPDI表達效果不理想，總蛋白樣品也未見明顯條帶；如圖2（C）所示，TrxsPDI具有很高的蛋白表達量以及很好的可溶性表達效果，T7sPDI和GSTsPDI有一定的可溶性表達，sPDI表達效果不理想；如圖2（D）所示，DsbC、TrxDsbC、T7DsbC以及GSTDsbC均能夠產生可溶性蛋白。

圖2 添加N末端標簽的SO和PDI的蛋白表達.

結果表明，通過添加N末端標簽策略hPDI和sPDI的表達水平顯著提高，并實現了可溶性表達。

2.2 可溶性表達系統的構建以及proCPB的可溶性表達

優選ERV1或TrxERV1分別與TrxsPDI、GSTsPDI、TrxhPDI、T7hPDI、GSThPDI或DsbC組合，它們在來源于Salmonella enterica的阿拉伯糖啟動子控制下，利用p15A ori-CmR骨架，可與裝載目的基因的pET系列載體配合使用。

培養菌株第0～3代，并誘導表達proCPB（45.97 kDa），豬羧肽酶原B以包涵體的形式存在于細胞中（圖3）。研究proCPB與添加了N末端標簽的SO-PDI共表達的效果，以E. coliBL21(DE3)為宿主，裝載質粒pETCPB與可溶性表達系統質粒（p0E-TS、p0E-GS、p0E-TH、p0E-7H、p0E-GH、p0E-0D、pTE-TS、pTE-GS、pTE-TH、pTE-7H、pTE-GH或pTE-0D）。加入誘導劑L-阿拉伯糖和IPTG，SDS-PAGE電泳結果如圖4所示。結果表明，ERV1-TrxsPDI和TrxERV1-TrxsPDI是優異的可溶性表達系統，可實現proCPB可溶性表達，而其他10種組合未能實現proCPB可溶性表達，證明SO-PDI作為可溶性表達系統可行，能夠用于目的蛋白的可溶性表達。

圖3 proCPB的表達

圖4 proCPB與SO-PDI系統的共表達.

2.3 更換可溶性表達系統ERV1-TrxsPDI的啟動子對proCPB表達可溶性的影響

以控制可溶性表達系統ERV1-TrxsPDI的啟動子為單變量，將阿拉伯糖啟動子變更為T7啟動子，研究啟動子或誘導劑對目的蛋白可溶性表達的影響，結果如圖5所示。結果表明，可溶性表達系統ERV1-TrxsPDI仍可促進目的蛋白proCPB可溶性表達，不受啟動子種類限制。

圖5 T7啟動子對proCPB可溶性表達的影響

2.4 單獨表達ERV1或TrxsPDI對proCPB表達可溶性的影響

為研究單獨表達ERV1或TrxsPDI對目的蛋白proCPB表達可溶性的影響，構建質粒p0E和pTS分別裝載ERV1基因和TrxsPDI基因，結果如圖6所示。ERV1與proCPB共表達時，proCPB主要以包涵體的形式存在，且部分ERV1也以包涵體的形式存在；TrxsPDI與proCPB共表達時，TrxsPDI對proCPB的可溶性表達能夠起到一定促進作用，但是大量的蛋白還是以包涵體的形式存在。結果表明，proCPB的可溶性表達是在SO-PDI共同作用下實現的。

圖6 ERV1或TrxsPDI單獨表達對proCPB可溶性表達的影響

2.5 可溶性表達系統穩定性

選擇CPB0、CPB11、第21代（無抗）（CPB11 Gen 21st）和第21代（有抗）（CPB11 Gen 21st(AC)）進行蛋白表達，如圖7所示。結果表明，傳代10天后proCPB仍可進行可溶性表達。利用大腸桿菌表達目的蛋白的一個工業生產周期（從種子培養到大規模發酵結束）通常少于10天，表明本研究的可溶性表達系統具有在工業生產中使用的潛力。

圖7 可溶性表達proCPB的穩定性

3 結論

本文通過篩選不同來源的二硫鍵異構酶聯用優化N末端標簽構建了一種新型可溶性表達系統，并成功實現豬羧肽酶原B的可溶性表達。該系統不受誘導劑和啟動子限制，具有傳代穩定性，可在工業生產中使用。