重組質粒pcDNA3.1（+）-TFEB-HA的構建、表達及鑒定

韓納姝，方榮灃，王振江，李薇

（1.內蒙古醫科大學 精神衛生學院，內蒙古呼和浩特 010110；2.內蒙古醫科大學 基礎醫學院，內蒙古呼和浩特 010110）

轉錄因子EB（Transcription Factor EB，TFEB）是小眼畸形轉錄因子家族成員之一，定位于6號染色體上，全長52 246 bp，編碼蛋白長度為19～159個氨基酸[1]。近年來，TFEB作為影響溶酶體功能、細胞自噬和細胞代謝等相關基因表達的轉錄因子成為研究熱點[2-3]。研究表明，TFEB是帕金森癥、阿爾茲海默癥等多種神經退行性疾病及癌癥的重要轉錄因子[4]，在胰腺癌[5]、糖尿病[6]的治療中可能起著重要的調控功能。隨著研究的不斷深入，TFEB作為頑疾尤其是作為治療腫瘤疾病的一種新的策略靶點得到了越來越多的研究人員的關注[7]。TFEB與腫瘤的發生、發展之間的關系已經取得了較多的研究成果。許多非整倍體腫瘤細胞系不顯示溶酶體飽和度，說明腫瘤細胞具有其他的機制來增強其降解能力[8]。腎細胞癌（RCC）是由腎小管上皮產生的異質性腫瘤，其中的易位RCC（t-RCC）是由MiTF/TFE家族成員TFE3和低頻率的TFEB有關的基因融合引起的[9]，對高分期的腫瘤的研究發現了包括TFEB在內的染色體6p擴增這一新的細胞遺傳學變化[5-10]。TFEB的表達與卵巢癌的自噬和侵襲性臨床特征相關，TFEB表達的高低是卵巢癌的預后因子[11]。過表達TFEBS142A突變體能夠刺激自噬發生，促進腫瘤生長[12]。

本研究擬將構建的重組表達質粒pcDNA3.1（+）-TFEB-HA轉染到HeLa細胞中并成功表達，為進一步研究TFEB對細胞生長的影響提供一個新的有力的工具，同時也可以為進一步研究從基因水平上治療腫瘤、神經精神等疾病提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 質粒、菌種及細胞

表達載體pcDNA3.1（+）質粒、大腸桿菌（E.coli）Top 10、人子宮頸癌HeLa細胞，均為本實驗室保存。

1.1.2 試劑

Pfu DNA聚合酶、DNA Marker、限制性內切酶（EcoRⅠ及BamHⅠ）、T4DNA連接酶、Taq DNA聚合酶、蛋白預染Marker及TurboFect?等，Thermo公司；DNA膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒，上海生工；胰酶、DMEM高糖培養基，Sigma公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；Opti-MEM培養基，Gibco公司；羊抗兔TFEB抗體、羊抗鼠β-actin抗體， Santa公司；680 goat anti-rabbit IgG（H+L）、680 goat anti-mouse IgG（H+L），Invitrogen公司。引物合成和基因測序由北京華大基因公司完成。

1.2 儀器與設備

TC-3000型PCR基因擴增儀，Techne公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；GelDocXR+型全自動DNA凝膠成像儀、Mini Protean 3 Cell型小垂直板電泳槽、1703940型半干轉膜儀、轉印槽，Bio-Rad公司；XDS-200型倒置顯微鏡，上海蔡康光學儀器有限公司；BB15型細胞培養箱，Thermo有限公司；CLX型Odyssey雙色紅外激光成像系統，LiCOR公司。

1.3 方法

1.3.1 設計引物

參考NCBI公布的人TFEB基因序列設計PCR引物，兩端分別加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點及保護堿基，下游引物連接HA標簽。引物序列上游為5’-GGAATTCATGGCGTCACGCATAGGGTTGC-3'，下游為5'-CGGGATCCTTAAGCGTAATCTGGAACATC GTATGGGTACAGCACATCGCCCTCCTCCATGC-3'。

1.3.2 PCR擴增

以HeLa細胞基因組為模板進行PCR擴增，反應體系：10× Pfu Buffer （含MgSO4) 10μL、dNTP Mix（10 mmol/L）2 μL、上下游引物（10 μmol/L）各2 μL、模板1 μL、Pfu DNA聚合酶（2.5 U/μL）1 μL、ddH2O 82 μL。PCR反應條件：95℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 3 min，共30個循環；72 ℃ 5 min。經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收純化DNA擴增產物。

1.3.3 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA表達載體的構建

將純化后的目的基因片段與pcDNA3.1（+）載體分別用EcoRⅠ及BamHⅠ雙酶切后純化回收，T4DNA連接酶于16 ℃連接過夜。連接產物轉化E.coliTop 10感受態細胞，在含有200 μg/mL氨芐霉素的LB液體培養基中，37 ℃、180 r/min，培養12～16 h。提取質粒，分別進行PCR驗證、雙酶切驗證及測序鑒定。

1.3.4 細胞培養

用含有10% FBS的DMEM培養基，于37℃、5% CO2培養箱中培養HeLa細胞，定期換液傳代。

1.3.5 質粒轉染

用 Turbofect? 將 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA 重組質粒轉染到細胞融合度達60%～70%的HeLa細胞中，37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h左右，更換新鮮培養基繼續培養。

1.3.6 Western Blot檢測

Western Blot檢測轉染及對照HeLa細胞TFEB蛋白表達水平，結果利用ODYSSEY紅外成像檢測。

1.3.7 統計學分析

應用統計學軟件SPSS 19.0進行統計分析，組間比較采用t檢驗，檢驗結果P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建及鑒定

構建了4個重組質粒 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA，雙酶切（EcoRⅠ/BamHⅠ）此4個重組質粒，經0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。重組質粒1的雙酶切產物在約1 500 bp處有一特異性條帶，大小與TFEB基因相符，另一條帶的大小與pcDNA3.1（+）載體大小相符，2、3、4中無TFEB基因條帶。說明重組質粒1構建成功。

圖1 重組質粒 pcDNA3.1（+）-TFEB-HA的雙酶切驗證

將PCR驗證和雙酶切驗證均正確的重組質粒1進行測序，測序結果表明融合基因無堿基突變和缺失，載體上插入的TFEB cDNA序列方向、位置及大小均正確，進一步證明pcDNA3.1（+）-TFEB-HA重組表達載體構建成功。

2.2 Western Blot檢測結果

按照方法1.3.5進行轉染并用Western Blot檢測，如圖2所示，轉染了重組質粒細胞的蛋白量（TFEBHA）明顯多于空質粒轉染組（Control），表明目的基因轉染成功。統計分析結果如圖3顯示，TFEB-HA組的TFEB蛋白表達水平顯著高于對照組。

圖2 Western Blot檢測轉染后TFEB-HA蛋白表達

圖3 TFEB-HA蛋白表達水平

3 結論

本研究構建的質粒能夠正確表達TFEB，構建的載體可行性好、不破壞細胞自身結構，易于觀察，方便定量表達外源蛋白，為進一步研究TFEB在腫瘤發生機制中的作用提供了一個新的工具，為從基因水平上治療腫瘤提供了一定的理論依據。