李嶺，黃銘銳，郭嘉鑫，陳志

（青海師范大學，青海西寧 810008）

鎖陽，首載于《本草衍義補遺》，為鎖陽科植物鎖陽（Cynomorium songaricumRupr.）的干燥肉質莖，又名不老藥[1]。主要含有有機酸類、黃酮類、三萜類、糖苷類、甾體類、氨基酸及無機離子等多種生理活性物質，抗寒耐干旱[2-4]。現代醫學研究證明，鎖陽可提高機體的免疫能力、清除自由基、抑制人體免疫缺陷病毒[5]。

鎖陽黃酮是指從鎖陽中提取的黃酮單體。近年來，黃酮類化合物日益受到人們的青睞，各種富含黃酮類化合物的植物中草藥資源相繼被開發利用[6]。其中，(-)-表沒食子兒茶素-3-O-沒食子酸酯（EGCG）可以通過清除機體氧自由基、減少氧自由基過度生成、激活內源性抗氧化應激機制、免疫調節等多種分子機制避免肺實質細胞損傷[7]。

肝細胞氧化損傷是導致許多肝病，諸如脂肪肝、肝炎、肝硬化、肝纖維化和肝癌等，的重要原因之一。盡管臨床上已有許多治療肝病的藥物，但是大多藥物的有效性與毒副作用問題仍然存在。因此尋找新的天然藥物，對于肝病的臨床治療具有重要意義。本研究通過探討鎖陽黃酮對過氧化氫誘導大鼠肝星狀細胞氧化損傷的保護作用，以期為肝病的臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鎖陽，購于青海省西寧市中藥房；大鼠星狀肝細胞，青海大學醫學院提供；SDS、MTT，Sigma公司；PBS（pH 7.4），上海前塵生物科技公司；胰蛋白酶-EDTA、DMEM高糖培養基、胎牛血清，Hyclone公司；大鼠丙二醛（MDA）ELISA試劑盒、大鼠一氧化氮合酶（NOS）ELISA試劑盒、大鼠細胞蛋白ELISA試劑盒，上海酶聯生物工程有限公司；HPD-722大孔吸附樹脂，滄州寶恩化工有限公司；聚酰胺層析薄膜，上海慧穎生物科技有限公司；其余試劑均為分析純，購自天津致遠化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

BX43熒光顯微鏡，日本奧林巴斯公司；BSC-1500B2-X生物安全柜，濟南圣科環保科技有限公司；Bio-Rad XMARK全自動酶標儀，上海閃譜生物科技有限公司；HF90二氧化碳培養箱，香港力康生物醫療科技控股有限公司；UV-1780紫外分光光度計，日本島津公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鎖陽黃酮提取及溶液配制

將鎖陽粉碎后過100目篩，石油醚脫脂后所得殘渣與5%NaOH溶液按1∶10的質量體積比進行配制，浸提3次，每次3 h，合并上清液。使用鹽酸酸化后用氯仿萃取，濃縮有機層。將所得浸膏用HPD-722大孔吸附樹脂富集鎖陽黃酮，再經聚酰胺柱層析分離富集，收集50%～75%乙醇洗脫液合并濃縮，冷凍干燥得到鎖陽黃酮粉末[8]。

提取物中總黃酮含量的測定按文獻[9]中的方法并稍作修改。以濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，測定提取物中的黃酮含量（LCH，%），鎖陽總黃酮含量（TFC，mg/g）計算方法如式（1）：

1.3.2 細胞培養

取大鼠肝星狀細胞移至一次性培養瓶中，加入含有1%雙抗、10%胎牛血清的細胞培養液，在37℃、5% CO2孵化箱中持續培育至對數生長期，后續實驗所需的大鼠肝星狀細胞均處于對數生長期。

1.3.3 過氧化氫溶液濃度的篩選

不同濃度的過氧化氫對大鼠肝星狀細胞的損傷程度各有差異，因此考察不同氧化劑濃度對細胞的致損狀況。考察過氧化氫濃度分別為200 μmoL/mL、400 μmoL/mL和800 μmoL/mL下大鼠肝星狀細胞的活力。調整細胞濃度為1×105個/mL，向孔板中加入不同濃度的過氧化氫溶液，MTT法檢測細胞活力。

1.3.4 鎖陽黃酮溶液對細胞的保護效果

實驗設立空白組、陰性對照組、過氧化氫損傷模型組（200 μmoL/mL）和鎖陽黃酮（濃度分別為0 μg/mL、12.5 μg/mL、25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、100.0 μg/mL和200.0 μg/mL）給藥組，每組3個復孔。37 ℃二氧化碳培養箱中培養1 h，在510 nm處測定OD值，每組實驗重復3次。

1.3.5 MDA、NOS、蛋白濃度的測定

取對數生長期的大鼠肝星狀細胞，用PBS洗滌后，經0.25%的胰酶消化離心去上清，調整細胞濃度。給藥組分別加入25 μg/mL、50 μg/mL和100 μg/mL的鎖陽黃酮溶液，培養12 h后按試劑盒操作步驟測定細胞中MDA、NOS及蛋白濃度。

1.4 數據處理

所有數據用SPSS 21.0統計軟件處理，數據用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗，P＜0.05視為差異具有統計學意義，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 鎖陽黃酮含量的測定

蘆丁標準曲線如圖1所示，經統計處理得回歸方程Y=12.120 5X-1.785 7×10-4，R2=0.999 9。根據標準曲線得提取物中的黃酮含量（LCH）為87%，從式（1）得鎖陽總黃酮含量（TFC）為202.83 mg/g。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 過氧化氫溶液濃度篩選

如表1所示，過氧化氫濃度與細胞的生長存活率呈現一定的量效關系。當細胞死亡率過大時（≥70%），說明該損傷濃度不具有實驗意義，故本實驗選取200 μmoL/mL的過氧化氫溶液建立體外氧化損傷模型。

表1 過氧化氫濃度對細胞生長存活率的影響（±s，n=9）

表1 過氧化氫濃度對細胞生長存活率的影響（±s，n=9）

注：與對照組比較，*為P＜0.05（差異顯著），**為P＜0.01（差異極顯著）。

組別 過氧化氫濃度/（μmoL/mL） 細胞生長存活率/%陰性對照組 100 200 42.88±3.21**400 25.72±2.73**800 14.15±3.02**實驗組

2.3 鎖陽黃酮樣品濃度的篩選

由圖2可知，在0～100 μg/mL濃度范圍內，鎖陽黃酮對過氧化氫誘導的大鼠肝星狀細胞損傷有一定的保護作用；當濃度大于100 μg/mL時，細胞存活率急劇減小；25～100 μg/mL的鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞的保護作用明顯。數據表明，高濃度的鎖陽黃酮（＞100 μg/mL）對大鼠肝星狀細胞的生長有抑制作用，因此本實驗選取濃度為25 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL的鎖陽黃酮進行細胞抗氧化損失實驗。

圖2 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞的保護作用

2.4 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞氧化損傷的保護作用

2.4.1 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞中蛋白濃度的影響

如表2所示，與對照組相比，模型組大鼠肝星狀細胞中的蛋白濃度顯著增加（P＜0.01），說明造模成功。而低、中、高劑量的鎖陽黃酮溶液使大鼠肝星狀細胞中的蛋白濃度分別減少13.59%（P＜0.05）、18.55%（P＜0.01）和26.38%（P＜0.01）。說明鎖陽黃酮可以抑制過氧化氫誘導的大鼠肝星狀細胞蛋白濃度的增加。

表2 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞氧化損傷的保護作用（±s，n=9）

表2 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞氧化損傷的保護作用（±s，n=9）

注：與模型組比較，*為P＜0.05（差異顯著），**為P＜0.01（差異極顯著）；與對照組比較，#為P＜0.05（差異顯著），##為P＜0.01（差異極顯著）。

組別 蛋白濃度/（g/L） MDA/（nmol/mg） NOS/（U/mL）對照組 15.41±1.32 1.32±0.13 9.19±0.82損傷模型組 33.04±2.87## 2.56±0.19## 6.32±0.59#25 μg/mL 鎖陽黃酮組 26.62±2.14* 1.83±0.08** 6.07±0.71 50 μg/mL 鎖陽黃酮組 26.91±2.84** 1.62±0.07** 7.56±0.73*100 μg/mL 鎖陽黃酮組 24.32±3.01** 1.55±0.14** 8.13±0.92*

2.4.2 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞中MDA的影響

如表2所示，當用200 μmol/mL的過氧化氫溶液對大鼠肝星狀細胞形成氧化損傷后，大鼠肝星狀細胞中的MDA含量增加到2.56 nmol/mg，細胞氧化損傷造模成功。加入低、中、高劑量不同濃度的鎖陽黃酮溶液后，大鼠肝星狀細胞中的MDA含量分別減少28.52%、36.72%和39.45%（P＜0.01）。說明鎖陽黃酮對過氧化氫誘導的大鼠肝星狀細胞MDA含量的增加具有拮抗作用。

2.4.3 鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞中NOS的影響

如表2所示，與對照組相比，模型組大鼠肝星狀細胞中的NOS含量顯著降低（P＜0.05），說明造模成功。低劑量的鎖陽黃酮溶液對氧化損傷的大鼠肝星狀細胞NOS無明顯影響（P＞0.05），而中劑量和高劑量的鎖陽黃酮溶液使大鼠肝星狀細胞中的NOS含量分別增加19.44%（P＜0.05）和28.57%（P＜0.05）。說明中、高濃度鎖陽黃酮對過氧化氫誘導的大鼠肝星狀細胞NOS表達的降低具有拮抗作用。

過氧化氫是一種重要的活性氧，極易通過細胞膜與細胞內鐵離子反應形成高活性OH·損傷細胞。細胞內氧化還原系統失衡，體內的高活性分子產生過多，細胞中出現大量自由基，引起大鼠肝星狀細胞結構及功能的改變，加劇肝細胞的損傷程度并導致組織損傷，而肝星狀細胞活化是引起肝纖維化的主要原因[9-11]。

黃酮類化合物對大鼠肝星狀細胞的氧化損傷有一定的保護作用。實驗數據表明，一定濃度范圍內（25～100 μg/mL）的鎖陽黃酮作用于過氧化氫處理的大鼠肝細胞時，有顯著的抗氧化作用。鎖陽黃酮通過提高受到抑制的細胞活性，改善細胞生長狀態，降低MDA含量，從而減少細胞壞死。當鎖陽黃酮濃度超過100 μg/mL時，鎖陽黃酮對大鼠肝星狀細胞的抑制率增加，表現出毒副作用。

3 結論

綜上所述，本研究表明鎖陽黃酮對于過氧化氫誘導的大鼠肝星狀細胞氧化損傷具有一定的保護作用，它提高了細胞存活率、降低了細胞蛋白濃度和MDA含量、增加了NOS蛋白表達水平。這將為鎖陽黃酮作為治療肝臟纖維化的天然藥物開發提供參考依據。