小白芨內生真菌的分離鑒定及產酶情況初步篩選

郭潔，樊竹青

（普洱學院，云南普洱 665000）

植物內生真菌是指生活史的一定階段生活于健康植物組織和器官的細胞內部，對植物自身沒有引起明顯的病害，并與植物自身建立密切關系的一類微生物[1-3]。植物內生真菌是宿主植物天然的微生態系統組成部分，對植物具有促生長的調控作用，可增強宿主植物的抗逆性。植物內生真菌能產生豐富的酶類和生物堿類、皂苷、芳香類等活性物質，對動植物及人病原菌體具有不同的抗菌性[3-5]。植物內生真菌產酶豐富，種類繁多，對酶工程的發展具有很大的潛在價值。作為一類重要的微生物資源，植物內生真菌為研究新型抗菌藥提供了豐富的資源。

小白芨（Bletilla striata）是蘭科植物多年生的草本藥用植物，內含豐富的小白芨多糖和小白芨膠，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化等功效[6]。近年來，對小白芨的藥理研究、化學成分分析、繁育栽培、多糖等提取的工藝研究方面較為廣泛，但對小白芨內生真菌的研究報道資料相對較少。陳青青等[7]對湖北鐘祥、陜西安康兩地的野生白芨進行了分離鑒定，而云南產小白芨屬植物內生真菌和酶活研究鮮有報道。本研究以云南宣威產小白芨為研究對象，采用形態鑒定和分子鑒定的方法，對小白芨內生真菌進行分析，增加宣威小白芨的基礎數據，以期為云南產小白芨屬植物內生真菌系統研究提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 菌種的來源

菌株分離自宣威所產無病蟲害的小白芨（Bletilla striata），供試菌株共2株，保存于普洱學院微生物學實驗室。

1.2 試劑

100 mL TE緩沖液，北京索萊寶科技有限公司；PCR擴增劑，福州生物公司； Tris-HCl，碧云天生物公司；100 mL 1×TAE緩沖液，上海麥克林公司；8200 Triton X-100，北京索萊寶科技有限公司；100 mL 6×Loading Buffer，北京索萊寶科技有限公司；500 μL核苷酸染料（GeneFinder染料），北京生物科技有限公司；100 mg DNA Marker（DL2000），上海研生有限公司；50T真菌基因組DNA提取試劑盒，德國QIAGEN；上游引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，250 μL，杭州星群儀器公司；下游引物ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，250 μL，杭州星群儀器公司。

1.3 儀器與設備

L96G型PCR擴增儀，杭州朗基科學儀器有限公司；DYY-8C型電泳儀，北京六一儀器廠；TL2600型生物顯微鏡，上海締倫光學儀器有限公司；SC-3616型離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；DNA自動測序儀，昆明碩擎生物公司；HZQ-X300型搖床,上海一恒科學儀器有限公司；GXZ-300B型恒溫培養箱，寧波東南儀器有限公司；SW-CJ-IF型超凈工作臺，托普儀器有限公司；QL-901型旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；CP224C型電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司；Starter2C型pH計，上海奧豪斯儀器有限公司；LDZX-75KBS型立式高壓滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；EPED-20TJ型純水儀，易普易達公司。

1.4 培養基的配制

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（分離純化培養基）：馬鈴薯（去皮）200 g、葡萄糖20 g、瓊脂10～12 g，水1 000 mL，pH自然。

淀粉培養基：淀粉 10 g、馬鈴薯200 g、瓊脂11～12 g，水1 000 mL，pH自然。

油脂培養基：蛋白胨10 g、牛肉膏5 g、氯化鈉5 g、花生油或香油10 g、瓊脂15～20 g、1.6%中性紅水溶液1 mL，水1 000 mL，pH6.9～7.1。

酪蛋白培養基：酪蛋白10 g、牛肉浸粉3 g、氯化鈉5 g、磷酸二氫鉀2 g、瓊脂15 g，水1 000 mL，pH7.3～ 7.5。

果膠培養基：果膠5 g、酵母膏5 g、硫酸鎂（MgSO4·7H2O）2 g、磷酸氫二鉀（K2HPO4）1 g、瓊脂20 g、剛果紅0.15 g，pH7.0～7.2。

1.5 內生真菌的分離純化

小白芨表面消毒法參照劉悅等[9]對刺五加的表面消毒法。菌種的分離純化采用3點種植法，用接種針挑取內生真菌的孢子或少量氣生菌絲接種于PDA培養基平板，接種的3個點成三角形，倒置于26～28 ℃的培養箱中培養4～5 d，觀察3個點菌落形態，直至3個菌落形態相同，并與原始記錄相符，則完成純化，將真菌轉接到斜面保存備用。

1.6 菌種的鑒定

1.6.1 內生真菌的形態學鑒定

將純化后的菌株接種在PDA培養基上，在培養3 d、7 d、15 d后分別觀察并記錄菌落形態，包括菌株的大小、顏色、質地、菌落邊緣和有無滲出物等情況。用插片法培養菌株5～7 d后，在顯微鏡下觀察蓋玻片上的菌絲形態，重點觀察菌絲是否有隔，分生孢子的形態、大小、著生情況、聚集方式和分生孢子梗的形態，觀察的同時進行拍照，對照《真菌鑒定手冊》[8]進行初步形態鑒定。

1.6.2 2株真菌產酶情況初篩

將經過分離純化的真菌分別接種至淀粉培養基、油脂培養基、蛋白質培養基和果膠培養基中，在28℃培養。每天觀察菌株的生長情況及是否有透明圈的產生，篩選具有明顯透明圈的真菌。

1.6.3 內生真菌的分子鑒定

選出具有明顯透明圈的2株真菌，進行分子鑒定。

1.6.3.1 內生真菌細胞總DNA材料的獲得

（1）25 mL PDA液體培養基分裝于50 mL的搖瓶中，121 ℃滅菌30 min備用。

（2）將菌株接種到無菌的PDA液體培養基中，28 ℃、180 r/min、搖床培養2～3 d后將菌體收集在1.5 mL Eppendorf管中。

（3）將收集好的菌體在8 000 r/min下離心4 min，倒掉上清液，用冰冷的等體積無菌水洗滌，再離心。

（4）用200 μL的裂解液重懸上一步中得到的細胞沉淀，混勻后加入2匙石英砂，苯酚、氯仿各200 μL，渦旋振蕩 5 min，加入 200 μL TE 緩沖液，充分混勻。

（5）13 000 r/min離心5 min，將上層水相轉移到干凈的Eppendorf管中，加入400 μL氯仿并翻轉混勻（輕混）。

（6）重復步驟（5），加入1 mL無水乙醇，充分混勻，13 000 r/min離心2 min。

（7）棄上清液，用1 mL 70%乙醇洗滌沉淀，13 000 r/min離心3～5 min。

（8）完全棄上清液，并將沉淀在烘箱中干燥至沉淀發白無酒精味。

（9）加入50 μL TE緩沖液重懸沉淀，4 ℃冰箱中過夜溶解，-20 ℃保存。

1.6.3.2 測定DNA濃度

為了提高實驗效果和縮短實驗時間，在PCR擴增前測定DNA濃度。用核酸測定儀測量波長260 nm的吸光值，然后直接在儀器上轉化成濃度、純度的讀數。

1.6.3.3 rDNA-ITS基因序列的PCR擴增

擴增程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR結束后，用DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

瓊脂糖凝膠電泳步驟如下。（1）取1.6 g瓊脂糖置于三角瓶中，加入75 mL 1×TAE緩沖液，瓶口蓋一塊布或者倒扣一個小燒杯，放在微波爐中加熱直到瓊脂糖溶解，待溶液冷卻至60 ℃左右時加入一滴GeneFinder染料，輕輕混勻，倒入制膠槽，待有機玻璃板表面形成均勻的膠層。（2）室溫下靜置20～25 min，膠層完全凝固后，將凝膠和內槽一起放在含有1×TAE緩沖液的電泳槽中，將準備好的梳子輕輕地插入膠層上，再輕拔出梳子，制成均勻的膠板樣品孔。（3）用移液器分別將2個樣品將各取9 μL PCR產物與1 μL 6×Loading Buffer混合后點樣加入膠板的樣品孔，待全部加完樣品后即可通電進行電泳（電壓200 V，電流200 mA）。電泳結束用紫外凝膠成像分析系統進行觀察拍照。DNA測序結果用Blast數據庫進行鑒定檢驗，構建進化樹，根據進化樹分析2株內生真菌之間的親緣關系和遺傳距離。

2 結果與分析

2.1 小白芨內生真菌的特征與鑒定

經過PDA培養基的分離純化，最終獲得純正的2個菌株，編號為M15和PDAX2，菌落形態見圖1、圖2、圖3。2株內生真菌根據形態鑒定到屬,初步確定內生真菌M15、PDAX2為青霉屬（Penicillium）菌株。

圖1 菌株M15培養7 d的宏觀菌落形態圖

圖2 菌株PDAX2培養7 d的宏觀菌落形態圖

圖3 菌株培養7 d的微觀菌落形態圖

表1 M15菌株菌落形態及顯微鏡下的形態特征

表2 PDAX2菌株菌落形態及顯微鏡下的形態特征

2.2 產酶情況初篩

經過培養觀察，菌株M15在蛋白質培養基、果膠培養基和脂肪培養基中產生透明的水解圈，PDAX2在淀粉培養基、蛋白質培養基和果膠培養基中產生透明圈。說明M15能產生蛋白酶、果膠酶和脂肪酶，PDAX2能產生淀粉酶、蛋白酶和果膠酶（見圖4、圖5）。

圖4 菌株M15出現水解圈的情況

圖5 菌株PDAX2出現水解圈的情況

2.3 小白芨內生真菌的分子生物學鑒定

根據基因序列構建的菌株M15、PDAX2系統發育進化樹如圖6所示。供試的2株真菌M15、PDAX2的DNA成功提取并擴增，將純化的DNA擴增結果送由昆明碩擎生物公司進行測序。將測序結果與GenBank中生物序列進行比對，比對序列輸入Mega5軟件，進行鑒定并構建系統發育樹，其鑒定結果如下：M15鑒定為青霉屬雷斯青霉菌（Penicillium raistrickii）；PDAX2鑒定為青霉屬波蘭青霉（Penicillium polonicum）菌。

圖6 根據基因序列構建菌株M15、PDAX2系統發育進化樹

在Blast的結果中，與M15比對上的序列是Penicillium raistrickii，與PDAX2相似度最高的是Penicillium polonicum菌株。在進化樹的結果中，序列之間親緣性與Blast結果相符合。同時，此次實驗測到的M15與PDAX2序列分別位于不同分支，其遺傳距離較大。

3 討論

我國國土遼闊，植物資源豐富，很多植物內生真菌的研究表明，每種植物中都蘊藏著豐富的內生真菌資源，但是由于特殊的環境和很多藥用植物內生真菌在人工培養基上無法生長，使得我國的植物內生真菌研究還不是很深，因此植物內生真菌亟待開發和挖掘[7]。現有基因工程和生物技術的快速發展，為研究植物內生真菌提供了便利，進一步加強了人類對植物內生真菌的探究，同時在尋找新的抗菌抗癌物質新藥、尋找酶類等方面具有深遠的意義[2]。

在本次的研究中，只是進行了形態鑒定和分子鑒定，對于小白芨研究還有很大的空白需要填充，內生真菌的資源非常豐富，由于條件有限，本研究只分離鑒定到2株。陳青青等[7]以湖北鐘祥、陜西安康的小白芨為樣品，分離到內生真菌24株，其分離到的菌株種類更多，與本實驗的研究結果相差較大，經分析，出現差異的原因可能如下：（1）二者的實驗材料地域結構相差較大，小白芨的內生環境、生理狀況相差較大，造成內生真菌相差較大；（2）實驗材料采集的季節不同，造成內生真菌的種類也不同；（3）二者所采實驗樣本數量的不同也會造成很大的差異。小白芨內生真菌研究很多關鍵性的問題有待解決，特別是應該加強內生真菌的鑒定這一方面，充分了解內生真菌和宿主的關系，提高小白芨種的藥用價值和經濟價值，同時也為保護小白芨的種質資源做好基礎性工作。

4 結論

通過對云南宣威產小白芨的研究，分離和鑒定出2株真菌，均為青霉屬菌株。通過分子生物學鑒定到種，M15為青霉屬雷斯青霉（Penicillium raistrickii），PDAX2為青霉屬波蘭青霉（Penicillium polonicum）。M15產生蛋白酶、果膠酶和脂肪酶，PDAX2產生淀粉酶、蛋白酶和果膠酶。