治痤膠囊高效液相色譜指紋圖譜建立及多成分含量測(cè)定*

凌 驄，徐 斌，劉亮鏡，王 權(quán)

（安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000）

治痤膠囊為安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院院內(nèi)特色制劑（皖藥制字Z20050016），由金銀花、酒黃芩、焦梔子、赤芍、牡丹皮、丹參、夏枯草等12味中藥組方，具有清泄熱毒、化濕通腑功效，臨床用于治療熱毒血濁型濕疹［1］、痤瘡的效果顯著，對(duì)脂溢性皮炎、酒糟鼻及皮膚潰瘍亦有良好療效。其現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅限定了丹酚酸B 含量，指標(biāo)單一，專(zhuān)屬性差，難以保證質(zhì)量和療效［2-4］。高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜具有整體性、特征性、可量化等特點(diǎn)，與中藥成分的復(fù)雜性、模糊性相適應(yīng)，是公認(rèn)的評(píng)價(jià)中藥制劑質(zhì)量的可靠方法［5-7］。為進(jìn)一步控制治痤膠囊質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性，本研究中建立了治痤膠囊的HPLC 指紋圖譜，并測(cè)定其中具有抗菌消炎活性作用的綠原酸、黃芩苷、梔子苷、芍藥苷、丹皮酚［8-13］的含量，以對(duì)該制劑的質(zhì)量進(jìn)行有效表征、綜合評(píng)價(jià)和全面控制。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent - 1200 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司），配有G1314B 型可變波長(zhǎng)檢測(cè)器；XP-205 型分析天平（精度為0.01 mg），AL - 204 型分析天平（精度為0.1 mg），均購(gòu)自梅特勒- 托利多儀器有限公司；KQ -500DB 型數(shù)控超聲儀（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，功率為200～500 W，頻率為40 kHz）；UPS-11-10T 型純水機(jī)（成都優(yōu)普凈化科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對(duì)照品（批號(hào)為110753 - 201415，純度為96.2%），梔子苷對(duì)照品（批號(hào)為110749-201617，純度為98.4%），芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)為110736-201741，純度為95.7%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為110715-201821，純度為95.4%），丹皮酚對(duì)照品（批號(hào)為110708 -201407，純度為99.9%），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈（分析純，美國(guó)Tedia Company公司）；磷酸（分析純，上海展云化工有限公司）；水為自制超純水；治痤膠囊（安徽省蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)分別為ZS201201，ZS201202，ZS201203，ZS210101，ZS210102，ZS210103，ZS210104，ZS210201，ZS210202，ZS210203，編號(hào)設(shè)為S1-S10）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件［14-20］

色譜柱：Waters XBridgeTM-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B），梯度洗脫（程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：330 nm（0～13.5 min，綠原酸），230 nm（13.5～42.0 min，梔子苷和芍藥苷），278 nm（42.0～60.0 min，黃芩苷和丹皮酚）；柱溫：20 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution procedure（%）

2.2 溶液制備

取綠原酸、梔子苷、芍藥苷、黃芩苷和丹皮酚對(duì)照品各適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為249.0，319.0，626.0，225.5，201.5 μg/ mL 的對(duì)照品貯備液；精密吸取此對(duì)照品貯備液1.0，1.0，0.5，2.5，0.5 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇定容，即得質(zhì)量濃度分別為24.900，31.900，31.300，56.375，10.075 μg/ mL 的混合對(duì)照品溶液。取樣品（批號(hào)為ZS201201）1 g，精密稱(chēng)定，置錐形瓶中，加入75%甲醇50 mL，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率為350 W，頻率為40 kHz）30 min，放至室溫，用75%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)；取續(xù)濾液2 mL，置5 mL容量瓶中，加75%甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。按樣品處方和制備工藝制備不含金銀花、焦梔子、赤芍、酒黃芩、牡丹皮的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.3 指紋圖譜建立

2.3.1 共有峰指認(rèn)

精密吸取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，共標(biāo)定16 個(gè)共有峰，根據(jù)保留時(shí)間指認(rèn)出1號(hào)峰為綠原酸，2號(hào)峰為梔子苷，3 號(hào)峰為芍藥苷，4 號(hào)峰為黃芩苷，5 號(hào)峰為丹皮酚。詳見(jiàn)圖1。

2.3.2 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次。以梔子苷峰為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.12%～1.04%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD為0.20%～2.67%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以梔子苷峰為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.09%～0.42%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD為0.32%～2.44%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為ZS201201）適量，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果以梔子苷峰為參照峰，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.17%～1.75%（n= 6），相對(duì)峰面積的RSD為0.53%～2.72%（n= 6），表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 相似度評(píng)價(jià)

取10 批樣品（批號(hào)分別為ZS201201，ZS201202，ZS201203，ZS210101，ZS210102，ZS210103，ZS210104，ZS210201，ZS210202，ZS210203）各適量，精密稱(chēng)定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，將色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）軟件，結(jié)果相似度分別為0.994，0.985，0.997，0.991，0.989，0.990，0.993，0.985，0.982，0.978。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性試驗(yàn)：精密吸取2.2 項(xiàng)下3 種溶液各適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照無(wú)干擾，表明方法專(zhuān)屬性良好。色譜圖見(jiàn)圖2。

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下芍藥苷和丹皮酚對(duì)照品貯備液各0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，梔子苷對(duì)照品貯備液0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，綠原酸對(duì)照品貯備液0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8 mL，黃芩苷對(duì)照品貯備液0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，分別置10 mL 容量瓶中，加甲醇定容，分別配制成系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表2。

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下供試品溶液適量，分別于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果見(jiàn)表2，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表2 線性關(guān)系考察及精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation，precision，stability and repeatability tests（n=6）

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為ZS201201）適量，精密稱(chēng)定，依法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表2，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（批號(hào)為ZS201201）0.5 g，精密稱(chēng)定，平行6份，置50 mL容量瓶中，依次加入綠原酸、梔子苷、芍藥苷、黃芩苷、丹皮酚對(duì)照品（質(zhì)量濃度分別為0.7076，0.7199，0.5237，0.7403，0.7836 mg/mL）2.0，2.5，1.8，5.0，1.0 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.3 Results of the recovery test（n=6）

2.4.2 樣品含量測(cè)定

取10 批樣品，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定3次，記錄峰面積，并按外標(biāo)法計(jì)算含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=3）Tab.4 Results of content determination of five components in the samples（mg/g，n=3）

3 討論

3.1 色譜條件選擇

中藥制劑各成分的最大吸收波長(zhǎng)不同，單波長(zhǎng)下的色譜信號(hào)弱，積分誤差大，而不同基線的多波長(zhǎng)檢測(cè)數(shù)據(jù)處理煩瑣［21-23］。故本研究中選用了可變波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器，根據(jù)目標(biāo)成分的最大吸收波長(zhǎng)，選擇了330 nm（綠原酸）、230 nm（芍藥苷和梔子苷）和278 nm（黃芩苷和丹皮酚）。磷酸溶液體積分?jǐn)?shù)考察了0.1%，0.2%，0.4%，柱溫考察了20 ℃和25 ℃，綜合比較5 個(gè)待測(cè)成分色譜峰的分離度和對(duì)稱(chēng)性，最終選擇0.2%磷酸溶液流動(dòng)相和20 ℃柱溫。

3.2 提取溶劑選擇

提取溶劑考察了甲醇、75%甲醇、50%甲醇，三者色譜峰數(shù)量無(wú)差異，但75%甲醇提取時(shí)響應(yīng)值最理想。故最終選擇75%甲醇為提取溶劑。

3.3 色譜峰數(shù)量與強(qiáng)度

建立指紋圖譜時(shí)，主要從5個(gè)待測(cè)成分色譜峰的分離度和分析時(shí)長(zhǎng)考慮，流動(dòng)相梯度洗脫至40%乙腈結(jié)束，樣品尚有部分極性較小的成分未被檢測(cè)到，導(dǎo)致色譜峰數(shù)量偏少；保留時(shí)間為30～40 min 時(shí)，有數(shù)個(gè)響應(yīng)值較小的色譜峰，色譜峰積分面積的RSD大于5%，未列為共有峰。

3.4 一測(cè)多評(píng)法

本研究中嘗試以梔子苷為內(nèi)標(biāo)物，按斜率校正法和多點(diǎn)校正法計(jì)算其余成分含量，并采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)各成分含量的3組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，結(jié)果2種一測(cè)多評(píng)法［24-25］與外標(biāo)法所得綠原酸和丹皮酚含量均有顯著差異（P＜0.05），故未能建立樣品的一測(cè)多評(píng)法，最終僅采用指紋圖譜指認(rèn)成分。