高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測人血清中帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利質量濃度*

高永雙，梁國朝，梁靈君，鄧順順，劉銳鋒

（1. 廣東省中山市第三人民醫院，廣東 中山 528400； 2. 廣東省中山市人民醫院，廣東 中山 528400）

精神科常用治療藥物的療效和藥品不良反應與其血藥濃度相關，治療藥物監測（TDM）是精神科藥物治療學的重要參考［1］。帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利若使用不當會產生毒副作用［1-2］，神經精神藥理學與藥物精神病學協會（AGNP）推薦臨床使用上述4種藥物時應進行TDM。目前，血藥濃度的一般監測方法包括高效液相色譜法、氣相色譜法、微生物法，但主要用于抗菌藥物［3］。參考文獻［4-5］，本研究中建立了同時檢測人血清中帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利質量濃度的高效液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）法。現報道如下。

1 儀器、試藥與空白血清

1.1 儀器

HPLC-MS/MS- 8040 型島津液相色譜三重四極桿質譜聯用儀（日本Shimadzu公司），包括DGU-20A3R型自動脫氣機，LC-20AD型二元高壓泵，SIL-20AHTUFLC 型自動進樣器，CTO - 20A 型可調柱溫箱；XW -80 A型旋渦混合器（上海醫大儀器有限公司）；B2T5S型分析天平（德國Sartorins 公司，精度為十萬分之一）；帕恩特XYB - H 型普通分析級純水機（北京湘順源科技有限公司）；5424R 型低溫高速離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 試藥

齊拉西酮對照品（批號為200601，純度為100%），喹硫平對照品（批號為201904，純度為99.6%），氨磺必利對照品（批號為200701，純度為99.9%），均購自中國食品藥品檢定研究院；帕利哌酮對照品（批號為14 -XJZ102-1，純度為99%），內標帕利哌酮-D4（批號為4-LHQ-44-1，純度為96%），內標齊拉西酮-D8（批號為3 - PSB - 24 - 1，純度為99%），內標喹硫平- D8（批號為1-AMA-53-2，純度為99.7%），內標氨磺必利-D5（批號為2-AMC-124-4，純度為99%），均購自加拿大Toronto Research Chemicals 公司；甲醇（色譜純，德國Slgma Aldrich公司，批號為11164207131）。

1.3 空白血清

來源于本院職工的體檢血液，離心，獲得血清，于-20 ℃保存。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex XB-C18柱（50 mm×3.0 mm，2.6 μm）；流動相：0.01%甲酸-水-乙腈（50∶37.5∶12.5，V/V/V）；流速：0.4 mL/ min；柱溫：45 ℃；進樣量：5 μL；運行時間：4.5 min。

2.1.2 質譜條件

電離源：電噴霧電離（ESI）正離子模式；加熱模塊溫度：450 ℃；脫溶劑管溫度：200 ℃；噴氣壓力：230 kPa；流速：20.0 L/ min；使用多反應監測模式掃描，帕利哌酮質荷比（m/z）427.20 →207.15、內標帕利哌酮-D4m/z431.20 →211.15，齊 拉 西 酮m/z413.10 →194.00、內標齊拉西酮-D8m/z421.20 →159.10，喹硫平m/z384.20 →253.00、內標喹硫平- D8m/z392.20 →258.05，氨磺必利m/z370.2 →242、內標氨磺必利- D5m/z375.20 →242.05，碰撞能量分別為40，26，31，50，40，22，45，24 eV；裂解電壓：135 eV。

2.2 溶液制備

對照品工作液：取帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利對照品各適量，用20%甲醇溶解，分別配成質量濃度為1.00 mg/ L 的對照品貯備液，于2～8 ℃冰箱保存，備用。臨用時，按需求照比例用20%甲醇稀釋各對照品貯備液，按對應質量濃度混合，制成對照品工作液。

內標工作液：取帕利哌酮-D4、齊拉西酮-D8、喹硫平-D8 和氨磺必利-D5 各適量，用20%甲醇溶解，分別配成質量濃度為1.00 mg/ L 的內標貯備液。臨用時，用20%甲醇稀釋至所需質量濃度，混合成內標工作液。

標準曲線溶液與質控樣品溶液：制備標準曲線溶液時，取空白血清95 μL，加入對照品工作液5 μL，渦旋混勻30 s，分裝成每管100 μL，加入對應量的對照品工作液，制成含藥血清標準曲線溶液，其中帕利哌酮質量濃度分別為5，10，25，50，100，250，500，1000 ng/mL，齊拉西酮分別為10，20，50，100，200，500，1000，2000 ng/mL，喹硫平分別為10，20，50，100，200，500，1000，2000 ng/mL，氨磺必利分別為10，20，50，100，200，500，1000，2000 ng/mL。低、中、高3個水平的血清質控樣品溶液中，帕利哌酮質量濃度分別為100，500，800 ng/ mL，齊拉西酮分別為200，1000，1600 ng / mL，喹硫平分別為200，1000，1600 ng/mL，氨磺必利分別為200，1000，1600 ng/mL。

2.3 乙腈蛋白沉淀法處理目標檢測樣本

取空白血清50 μL，置1.5 mL 離心管中，加入內標工作液50 μL（利培酮-D4、帕利哌酮-D4、齊拉西酮-D8、氨磺必利- D5 質量濃度分別為200，200，500，500 ng/mL），充分混勻，加入乙腈450 μL，渦旋混勻5 min，4 ℃條件下離心（轉速為15000 r/ min）5 min，取100 μL 上清液，置專用帶內插管的進樣瓶中分析。

2.4 方法學考察

專屬性試驗：取空白血清100 μL，共4份，分別不加分析物和內標、加內標、加分析物、加分析物和內標，按普通樣本試驗流程操作。結果帕利哌酮和帕利哌酮-D4、齊拉西酮和齊拉西酮-D8、喹硫平和喹硫平-D8、氨磺必利和氨磺必利- D5 的保留時間分別為2.416，2.407，2.435，2.395 min。離子色譜圖見圖1。可見，各樣品單峰明確，峰面積能進行有效計算，出峰時間差異顯著；血清中基質對分析物和內標干擾不明顯，目標專屬性測定信號清晰穩健，信噪比高。

線性關系考察與定量下限確定：按2.2項下方法制備含有4 種藥物的血清標準曲線溶液，按2.1 項下測定條件測定。以質量濃度（X）為橫坐標、峰面積與內標峰面積的比值（Y）為縱坐標，采用加權（1/X2）最小二乘法進行回歸擬合。結果見表1。結果表明，該方法可有效檢測目標藥物的血藥濃度，且可準確定量。

表1 線性關系考察與定量下限確定結果Tab.1 Results of the linear relation test and LLOQ

精密度試驗與回收試驗：按2.2項下方法分別制備各分析物覆蓋線性范圍的低、中、高水平的血清質控樣品溶液，按2.1項下測定條件進樣檢測，同一批、同一天內低、中、高水平樣本連續分別獨立測試5 次，檢測3 d后共獲得60 個測試數據；空白血清中加入不同質量濃度的對照品工作液后，制備低、中、高水平的樣本，每組每個水平5 份樣品，計算提取回收率（計算方法為質控樣品中待測物或內標的響應信號與空白樣品提取液中待測物或內標的響應信號的比值）。結果各待測物的回收率為92.06%～108.14%，日內及日間精密度試驗的RSD均低于15%。詳見表2。

表2 精密度試驗與回收試驗結果（n=15）Tab.2 Results of the precision test and the recovery test（n=15）

穩定性試驗：取2.2項下對照品貯備液及精密試驗項下低水平的各待測物血清質控樣品溶液，各3 份，分別于常溫避光條件下放置1 h 和24 h，以及-20 ℃條件下保存1 d 和14 d，同時考察質控樣品溶液分別于-20 ℃、-70 ℃條件下放置1次、3次和5次反復凍融的穩定性。結果上述條件下的含量均在85%～115%，RSD均小于15%（n=15），表明血清質控樣品溶液放置穩定性和反復凍融穩定性均良好。

2.5 基質效應

取6 份不同來源的空白血清，按2.3 項下方法處理，各制備9個空白血清樣品，共3組，每組3個，分別加入低、中、高水平對照品工作液5 μL和內標工作液20 μL，渦旋振蕩5 s，離心（轉速為14650 r/min）5 min。取上清液100 μL，進樣，獲得MA。另取95 μL 去離子水3 份，各加入低、中、高水平對照品工作液5 μL、內標工作液20 μL 和乙腈0.5 mL，渦旋5 s，取混合液100 μL 進樣，獲得MB。基質效應（%）=MA/MB×100%。按色譜峰峰面積計算帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利的含量，其RSD均小于15%（n=9），目標待測物在對照品溶液中的質譜響應無差異，不影響目標待測物的準確定量，表明方法穩健性良好。

3 討論

本研究中建立了測定帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利血清質量濃度的HPLC - MS/ MS 法，可完全滿足精神類藥物血藥濃度監測的效率［6-7］。采用乙腈蛋白沉淀法對人血清樣本進行前處理，濃度梯度試驗及標準曲線擬合分析進行定量測定，并參考2015年版《中國藥典（四部）》通則中“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”［6］對該方法進行驗證。結果基質因子的變異系數小于15%，說明空白基質的干擾小。處理后的樣品在常溫避光條件下放置1 h 和24 h、-20 ℃條件下保存1 d 及14 d 分析測試結果穩定；帕利哌酮在5.00～1000.00 ng/ mL，齊拉西酮、喹硫平、氨磺必利在10.00～2000.00 ng/mL 范圍內均有良好的線性關系，R2均大于0.9900，說明該方法的準確度高、精密度好。

樣本經過有機溶劑沉淀蛋白后即可進行分析，前處理方法簡單，可實現大量臨床樣本的快速分析［7］。相較于液液萃取法和固相萃取法，不但提高了靈敏度，且有利于改善結果可視化的峰形特征。以同位素化合物為內標，可簡化色譜行為，確保質譜行為一致，有效降低溶血、高脂血及高膽紅素血樣等特殊血樣對檢測結果的影響［8］。目前，國內市場仍無可用來檢測這些藥物血藥濃度的試劑盒，故需通過實驗室自建方法來完成。未來可設計出快速對帕利哌酮、齊拉西酮、喹硫平和氨磺必利進行高通量定量分析的試劑盒，以提高臨床檢測效率和檢測質量，滿足血藥濃度監測的要求。