AGTR1 過表達(dá)對肝細(xì)胞癌細(xì)胞株BEL-7404 生長的影響*

蔣會(huì)榮，黃 皓，李曉龍，張馨月，臺(tái)宗光，朱全剛，鮑蕾蕾，4△

（1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，安徽 蚌埠 233030； 2. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第三附屬醫(yī)院，上海 200438；3. 上海市皮膚病醫(yī)院，上海 200443； 4. 中國人民解放軍海軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院，上海 200433）

肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌最常見的類型，由于其血管明顯異常，如動(dòng)脈化和毛細(xì)血管化，導(dǎo)致血流異常、滲漏過多等［1-2］，認(rèn)為是典型的血管生成性腫瘤［3］。LEVER 等［4］的一項(xiàng)針對患者服用血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，服用該類藥物患者患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)更低，也證明了血管緊張素受體抑制劑（ARB）可降低患癌風(fēng)險(xiǎn)［5］。另外，發(fā)現(xiàn)腎素血管緊張素（Ang）系統(tǒng)中一個(gè)編碼血管緊張素Ⅱ1 型受體（AT1R）的基因AGTR1 在多種腫瘤中有異質(zhì)性表達(dá)，且該基因的過表達(dá)會(huì)引起多種腫瘤（如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌等）的不良預(yù)后［6-9］，但HCC 中AGTR1的表達(dá)情況及其對HCC 的影響尚不清楚。越來越多的研究表明，瞄準(zhǔn)Ang Ⅱ/AT1R 軸可通過減少血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFA）的表達(dá)來抑制血管生成和減少血管滲透，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移［10-12］。AGTR1可能通過增加VEGFA 的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，同時(shí)抑制劑洛沙坦可通過抑制腫瘤血管的生成來影響腫瘤的生長。本研究中通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了過表達(dá)AGTR1 的肝癌細(xì)胞，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究AGTR1 對腫瘤生長的影響，以及AGTR1 與VEGFA 表達(dá)的關(guān)系，同時(shí)考察AGTR1抑制劑洛沙坦在體內(nèi)對血管生成的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥、細(xì)胞株與動(dòng)物

儀器：ABI 7300 型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀（美國ABI 公司）；Tannon 1600 型全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能公司）；Thermo 240型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）；Olympus ck × 53 型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

試藥：RPMI 1640 培養(yǎng)基（美國Hyclone 公司，批號(hào)為SH30809.01B）；胎牛血清（法國Biowest 公司，批號(hào)為S1400）；0.25%Trypsin - EDTA（美國Gibco 公司，批號(hào)為15400054）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（日本Beyotime公司，批號(hào)為P0010）；SYBR Premix EX Taq（日本TaKaRa公司，批號(hào)為639676）；引物（上海生工生物工程有限公司，批號(hào)為B661104）；M - PER（批號(hào)為78501），T -PER（批號(hào)為78510），均購于美國Thermo 公司；AGTR1特異性一抗（美國Santa Cruz公司，批號(hào)為sc-29750）；三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH，Cell Signaling Technology公司，批號(hào)為97166）；Plasmid Maxi Kit（E.Z.N.A公司，批號(hào)為D2485）；Cell Counting Kit - 8（CCK - 8）試劑盒（日本Dojindo 公司，批號(hào)為CK04）；Transwell 小室（美國Corning 公司，批號(hào)為Scipu001412）；Puromycin（德國Sigma 公司，批號(hào)為AB3258）；Isoflurane（深圳瑞沃德公司，批號(hào)為R510-22）；洛沙坦（MedChem Express，規(guī)格為1 g，批號(hào)為20170307）。

細(xì)胞株：BEL-7404肝癌細(xì)胞株購自ATCC細(xì)胞庫。

動(dòng)物：6 周齡雄性BALB/ c 裸鼠（上海畢凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK ＜滬＞2013 -0016），于26 ℃條件下，置動(dòng)物隔離器中飼養(yǎng)。

1.2 方法

TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲取數(shù)據(jù)：通過網(wǎng)址https：// cancergenome.nih.gov/登陸TCGA 數(shù)據(jù)庫，檢索HCC RNA芯 片 數(shù) 據(jù) 集，下 載2018年1月5日至3月5日TCGA -2V - A95S～TCGA - G3 - A25S（374 肝癌RNA - Seq）和TCGA-BC-A10Q～TCGA-G3-A3CH（50 例癌旁樣本）的RNA-Seq及臨床數(shù)據(jù)，檢索AGTR1和VEGFA基因，并整理其表達(dá)值，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)性分析。

細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：BEL-7404細(xì)胞置RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素），并置含5% CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的BEL -7404細(xì)胞，均勻接種至6孔板中培養(yǎng)（3×105個(gè)細(xì)胞/孔），待細(xì)胞生長至30%～50%時(shí)，將2 μg 質(zhì)粒DNA 加入100 μL Opti-MEM 稀釋，將4 μL jetPEITM 加入100 μL Opti - MEM 稀釋，將稀釋后的jetPEITM 加入質(zhì)粒稀釋液中，輕輕混勻，室溫孵育20～30 min。然后將200 μL混合液滴加至換有新鮮培養(yǎng)液的6 孔板中，輕輕混勻，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT - PCR）檢測基因表達(dá)：組織中RNA 采用TRIzol（Invitrogen）法提取，用Fast200 試劑盒提取細(xì)胞中mRNA。逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒的反應(yīng)條件為42 ℃、20 min 和85 ℃、5 min。SYBR Green試劑盒用于qRT-PCR，反應(yīng)條件為預(yù)變性95 ℃、30 s，40個(gè)循環(huán)（95 ℃、5 s，57 ℃、45 s，72 ℃、45 s），72 ℃、60 s。GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計(jì)算相對定量。引物序列為AGTR1（Sense ATCCCAGAAAGTCGGCACCAGATG，Anti - sense TGACTTTGGCTACAAGCATTGTGCG）；GAPDH（Sense GAGCGAGATCCCTCCAAAAT，Anti -sense RGGCTGTTGTCATACTTCTCATGG）。

蛋白免疫印跡法檢測細(xì)胞表達(dá)：收集細(xì)胞，離心（轉(zhuǎn)速為3500 r/min）5 min，向細(xì)胞中加入300 μL M-PER后4 ℃冰浴30 min（期間每10 min振蕩1次），離心（轉(zhuǎn)速為12000 r/min）15 min，收集蛋白質(zhì)。采用BCA 法測定蛋白質(zhì)濃度，定量后上樣，混勻，100 ℃加熱5 min，冷卻后上樣10 μL（50 μg蛋白/泳道）。將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，并在室溫條件下用TBST封閉2 h，加入相應(yīng)濃度的一抗，4 ℃孵育過夜；次日用TBST洗脫3次，每次15 min；加入二抗孵育1 h。加入顯影檢測試劑與膜蛋白充分混勻，室溫孵育5 min，用凝膠成像儀曝光并拍照。

CCK-8法檢測細(xì)胞增殖：收集細(xì)胞，以每孔100 μL（2× 103個(gè)細(xì)胞/孔）置96 孔板，每組重復(fù)6 個(gè)。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別培養(yǎng)指定時(shí)間后加入CCK-8試劑，置37 ℃孵育2 h，測量450 nm波長處的吸光度（OD）值。

克隆形成實(shí)驗(yàn)：將收集的細(xì)胞接種至50 mm 平皿中，接種單位為2000個(gè)細(xì)胞/皿，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，使用4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞15 min，再加入0.1%結(jié)晶紫液染色30 min，用清水清洗3 次，室溫風(fēng)干后拍照并計(jì)數(shù)。

Transwell 法檢測細(xì)胞侵襲和遷移：用無血清的培養(yǎng)液將細(xì)胞置24 孔Transwell 板的上層小室中，將含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基加入下層小室，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)組，培養(yǎng)48 h 后取出上層小室，擦拭掉上層未穿過的細(xì)胞，用4%多聚甲醛溶液固定穿透細(xì)胞15 min，使用0.1%結(jié)晶紫染液染色30 min，使用倒置相差顯微鏡，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野，計(jì)數(shù)被染成紫色的細(xì)胞數(shù)量。檢測細(xì)胞遷移和侵襲時(shí)，分別使用不含Matrixgel 膠和含Matrixgel 膠的Transwell小室，其他操作步驟一致。

腫瘤模型構(gòu)建：利用胰酶將過表達(dá)AGTR1的BEL-7404 肝癌細(xì)胞消化，使用磷酸鹽緩沖液（PBS）重懸細(xì)胞，置離心機(jī)中離心（轉(zhuǎn)速的1000 r/ min）5 min，用PBS 重懸細(xì)胞2 × 106個(gè)/ 100 μL，用胰島素針將細(xì)胞懸浮液注射入裸鼠的背部皮下。4 周后采用游標(biāo)卡尺測量并記錄腫瘤體積，腫瘤體積按公式V=1/2×L×W2計(jì)算。

免疫組化：將石蠟切片，脫蠟，復(fù)水，蒸餾水沖洗后置PBS 中浸泡5 min，抗原修復(fù)后使用3% H2O2孵育15～20 min，從而消除內(nèi)源性過氧物酶活性。滴加封閉液，于室溫下孵育15～20 min，添加適當(dāng)稀釋比例的一抗，于4 ℃孵育過夜。使用PBS 沖洗3 次，每次3 min，添加二抗覆蓋組織，室溫孵育50 min 后使用PBS 沖洗3 次，每次3 min，加入DAB 顯色液，蘇木素復(fù)染3 min，沖洗，脫水，透明，封片。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Graphpad 6.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。采用單因素方差分析進(jìn)行組間差異的顯著性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 中AGTR1 與VEGFA 表達(dá)的關(guān)系

374 例HCC 樣本數(shù)據(jù)集中，AGTR1 和VEGFA 具有一定相關(guān)性（r= 0.27，P＜0.0001），詳見圖1 A。分析AGTR1表達(dá)的前80例（n=high 80）和后80例（n=low 80）樣本與VEGFA的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)在AGTR1高表達(dá)（n=high 80）的樣本中，AGTR1 與VEGFA 的相關(guān)性增強(qiáng)（r= 0.46，P＜0.0001），詳見圖1 B；在AGTR1低表達(dá)（n=low 80）的樣本中，AGTR1 與VEGFA 無相關(guān)性（r=-0.00905，P=0.9365），詳見圖1 C。選擇HCC 細(xì)胞系BEL-7404細(xì)胞轉(zhuǎn)染AGTR1 和對照空載質(zhì)粒，當(dāng)AGTR1 表達(dá)量提高時(shí)，VEGFA 的蛋白水平顯著上調(diào)（P＜0.001），詳見圖1 D和圖1 E。

2.2 AGTR1 差異表達(dá)對BEL - 7404 細(xì)胞生長和體外轉(zhuǎn)移的影響

細(xì)胞生長：采用CCK-8法考察BEL-7404細(xì)胞轉(zhuǎn)染AGTR1 和對照空載質(zhì)粒后細(xì)胞間活力的差異，結(jié)果BEL-7404 細(xì)胞組48 h 出現(xiàn)增殖差異（P＜0.05），隨著時(shí)間的延長差異更明顯（圖2 A），提示過表達(dá)AGTR1的BEL-7404 細(xì)胞的增殖能力較其對照空載細(xì)胞明顯增強(qiáng)。克隆形成實(shí)驗(yàn)用于檢測BEL - 7404 細(xì)胞在過表達(dá)AGTR1和對照空載細(xì)胞的生長差異，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)AGTR1的BEL-7404細(xì)胞的克隆形成能力較其對照空載細(xì)胞更強(qiáng)（圖2 B）。

體外轉(zhuǎn)移：采用Transwell 法檢測AGTR1 差異表達(dá)的BEL - 7404 細(xì)胞在遷移和侵襲能力方面的差異，考察AGTR1差異表達(dá)對BEL-7404細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果表明，過表達(dá)AGTR1的BEL-7404細(xì)胞較其對照空載細(xì)胞的體外遷移和侵襲能力均顯著增強(qiáng)（P＜0.001）。詳見圖2 C和圖2 D。

2.3 抑制AGTR1 對VEGFA 表達(dá)的影響

HCC 數(shù)據(jù)集分析和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，AGTR1 與VEGFA的表達(dá)在HCC細(xì)胞中存在相關(guān)性，且AGTR1的過表達(dá)能促進(jìn)BEL-7404細(xì)胞的增殖和遷移。使用AGTR1抑制劑洛沙坦，在轉(zhuǎn)染前預(yù)先用50 μmol/ L 的洛沙坦處理細(xì)胞2 h，對BEL-7404細(xì)胞轉(zhuǎn)染AGTR1和對照空載質(zhì)粒48 h 后，采用蛋白免疫印跡法考察細(xì)胞在洛沙坦處理后AGTR1和VEGFA蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，洛沙坦能不同程度地抑制AGTR1過表達(dá)的BEL-7404細(xì)胞中AGTR1 和VEGFA 的表達(dá)（P＜0.01），對AGTR1低表達(dá)的BEL - 7404 細(xì)胞中VEGFA 的表達(dá)無影響（P＞0.05）。詳見圖3 A至圖3 C。

2.4 抑制AGTR1 對腫瘤生長和血管形成的影響

采用過表達(dá)AGTR1 的BEL - 7404 細(xì)胞構(gòu)建裸鼠皮下成瘤模型，成瘤1 周后，給予低、中、高劑量洛沙坦（20，40，80 mg / kg），4 周后測量腫瘤體積。結(jié)果顯示，洛沙坦可以抑制腫瘤的生長，劑量為20 mg / kg時(shí)，具有不同程度的生長抑制作用（P＜0.05）。詳見圖3 D 和圖3 E。

同樣按上述處理方式，采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法檢測成瘤裸鼠血清VEGFA 水平，發(fā)現(xiàn)不同處理組間血清VEGFA 水平出現(xiàn)不同程度的差異，當(dāng)洛沙坦劑量增至40 mg/kg時(shí)，血清VEGFA水平顯著下降（P＜0.05）。詳見圖3 F。為了進(jìn)一步了解洛沙坦對腫瘤血管形成的影響，通過免疫組化法檢測CD31陽性細(xì)胞水平，考察其對腫瘤血管形成的影響。與對照組比較，不同劑量的洛沙坦可不同程度地抑制腫瘤血管形成。詳見圖3 G。

3 討論

血管生成的阻斷一直被認(rèn)為是抑制腫瘤生長的有效機(jī)制。目前，大多數(shù)獲批的一線和二線晚期HCC 的治療目標(biāo)是血管生成途徑［13］。VEGF/ VEGFRs 信號(hào)通路作為參與腫瘤血管生成的重要通路，已作為治療HCC 的藥物靶點(diǎn)［14-15］。VEGFA 是血管生成過程如內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移中最關(guān)鍵的配體［16-18］。因此，積極尋找有效的靶點(diǎn)抑制劑為肝癌患者的治療指明了新的方向，通過確定并檢測腫瘤標(biāo)志物對有效診斷和治療肝癌的重要性也不容忽視［19-20］。

LI等［21］的研究發(fā)現(xiàn)，服用ACEI可降低患癌風(fēng)險(xiǎn)，但部分學(xué)者在相關(guān)研究中并未得到類似結(jié)果。甚至有研究發(fā)現(xiàn)，ARB 的使用可能會(huì)增加患癌風(fēng)險(xiǎn)［22］。上述研究結(jié)果的差異可能與患者的種族、服藥周期、數(shù)據(jù)處理方式等因素相關(guān)。結(jié)合本研究結(jié)果，洛沙坦在AGTR1過表達(dá)的患者中受益可能性更大，故應(yīng)將患者個(gè)體的基因表達(dá)譜納入是否服用ACEI/ARB的考慮因素。本研究中發(fā)現(xiàn)，AGTR1 與VEGFA 的表達(dá)具有一定相關(guān)性，且在高表達(dá)AGTR1 的患者中相關(guān)性更強(qiáng)，洛沙坦可以抑制AGTR1過表達(dá)引起的VEGFA 表達(dá)上調(diào)，均表明AGTR1 過表達(dá)在HCC細(xì)胞增殖、侵襲、血管形成等方面具有重要作用。

綜上所述，AGTR1的過表達(dá)可促進(jìn)HCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制可能與增加VEGFA表達(dá)有關(guān)。洛沙坦作為靶向AGTR1 抑制劑，在一定程度上降低了VEGFA 的水平，可為ACEI 用于治療AGTR1 高表達(dá)的HCC患者提供參考。